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细胞样本免疫荧光(ICC)---双标

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武汉华联科生物技术有限公司

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动物饲养、笼位出租、动物模型研发、疾病模型定制、基因编辑、净化、扩繁、保种、中药安全性评价、药理药效评价、抗体筛选发现、综合检测等

武汉华联科生物技术有限公司总部位于生物产业园----武汉光谷生物医药园。公司成立于2014年4月,建有4000多平方米的办公楼,1700多平方米的实验检测平台、药物安全性评价及药物筛选等平台,配置1000多万的实验仪器设备。已建成800多平方米的SPF级动物房和普通级动物房,建有实验动物研发平台。

公司开展的服务项目有动物饲养、笼位出租、动物模型研发、疾病模型定制、基因编辑、净化、扩繁、保种、中药安全性评价、药理药效评价、抗体筛选发现、综合检测等项目。

公司与华中科技大学避孕节育新技术国家地方联合工程实验室共建理事单位,与华中农业大学和湖北大学建立了研究生工作站,与华中农业大学、湖北大学、武汉科技大学、中南民族大学、湖北中医药大学、武汉纺织大学、武汉生物工程学院等高校建立了产学研合作。我们秉承高品质、高效率、高标准的经营宗旨,持续推进科研成果转化,助力产业化发展。

 

详细信息

1. 原理

    免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞内的相应抗原(或抗体)。在细胞中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,荧光素受激发光的照射,由低能态进入高能态,而高能态的电子是不稳定的,以辐射光量子的形式释放能量后,再回到原来的低能态,这时发出明亮的荧光,利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术测定含量。免疫荧光技术分直接法、间接法和补体法,zui常见的为间接法。

    在同一细胞标本上需要同时检测两种抗原时,需进行双重荧光染色,称为免疫荧光双标。用未标记的两种特异性*抗体孵育细胞,洗去多余的*抗体后,再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育细胞,洗去多余的第二抗体,后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性*抗体必须来源于不同种属,且荧光标记第二抗体的种属必须与*抗体的种属相匹配。

2. 实验步骤

(1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3 min;
(2)用4%的多聚甲醛固定爬片15 min, PBS浸洗玻片3次,每次3 min;
(3)用0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);
(4)PBS浸洗玻片3次,每次3 min;

(5)在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30 min;
(6)吸水纸吸掉封闭液,不洗,同时滴加两种一抗混合液并放入湿盒,4℃孵育过夜;
(7)PBST浸洗爬片3次,每次5 min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗混合液,湿盒中20-37℃孵育1 h;

(8)PBST浸洗爬片3次,每次5 min;

(9)滴加DAPI避光孵育5 min,对标本进行复染核,PBST、5 min×4次洗去多余的DAPI;(10)用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片;

(11)在荧光显微镜下观察。

3. 注意事项

(1)两种一抗要来源于两种不同的动物;

(2)二抗用两种不同荧光信号标记,且各自信号相互不干扰或干扰性小;

(3)荧光染色后一般在1 h内完成观察,或于4℃保存4 h,时间过长,会使荧光减弱;
(4)每次试验时,需设置以下三种对照:

     阳性对照:阳性血清+荧光标记物
     阴性对照:阴性血清+荧光标记物
     荧光标记物对照:PBS+荧光标记物;

(5)抗体浓度和孵育时间需要事先摸索。

服务项目收费标准标本要求备注
细胞样本免疫荧光(ICC)---双标280元/样本/指标固定后的细胞爬片客户提供一抗,本价格包含拍照及染色,不包含特殊分析

注意事项: 

1.新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上; 

2.取材切面要平整,厚度不宜超过2mm; 

3.请明确拍照部位及拍照倍数(一般为40X、100X、200X、400X)。

 

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