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BC0385 丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测试剂盒 微量法

型号
BC0385
参数
CAS:详询客服 纯度:详询客服 分子量:详询客服 分子式:详询客服 供货周期:现货 规格:100T/96S 货号:BC0385 应用领域:环保,化工,生物产业,农业,综合 主要用途:丙酮酸脱氢酶活性测定
北京索莱宝科技有限公司

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公司拥有一批专业的研发人员,我们专注于生物产品的不断完善和创新。产品覆盖面广,品质可靠。先后开发了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、生物医学等领域的多种试剂及试剂盒。同时,索莱宝公司提供各种常规生化试剂,库存常备产品多达10000多种,可随时为广大科研工作者提供各类专业试剂。在质量方面,索莱宝谨记公司信念:质量高于一切。所有研发的产品都设有严谨的生产流程,科学的质量检测方法和成熟的质量检测程序,我们恪守对每一位用户的承诺:用专业的态度做专业的品牌。同时,公司组建了一支专业的技术服务队伍,能够为科研工作者提供专业的技术服务。每一位购买索莱宝产品的用户都能够得到专业的咨询和完善的售后服务。

索莱宝公司坚持与接轨,注重和企业的合作与交流,并提供产品代理、市场咨询等多项服务。公司将一如既往与世界更多合作,不断为广大生物科研工作者提供更优质的产品和服务。公司理念:“为科研服务,为生命尽责”。一个人能够走多远,取决于与谁同行。索莱宝公司期待与各同行精诚合作。

索莱宝诚招生物试剂研发人员,期待与广大同行精诚合作,为广大科研工作者提供优质的产品,高效的物流以及专业的售后服务。索莱宝感谢所有朋友的支持与帮助,您的支持是我们前进的动力和保障。让我们携手同行,共同创造美好的明天。

 

 

 

 

 

 

详细信息

丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测试剂盒说明书  微量法

注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。

货号:BC0385

规格:100T/96S

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测试剂盒 微量法

丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测试剂盒 微量法


试剂名称

规格

保存条件

试剂一

液体110 mL×1瓶

2-8℃保存

试剂二

液体0.6 mL×2支

-20℃保存

试剂三

液体7.5mL×2瓶

2-8℃保存

试剂四

液体13mL×1瓶

2-8℃保存

试剂五

粉剂×2支

-20℃保存

试剂六

液体1mL×1

2-8℃保存

试剂七

液体4mL×1瓶

2-8℃保存

溶液的配制:

1. 试剂二为易挥发试剂,用完后尽快密封,-20保存。

2. 工作液的配制:临用前把5.75mL试剂四、一支试剂五、0.45mL试剂六、1.75mL试剂七转移到一瓶试剂三中混合溶解待用(共15.45mL,约85T;用不完的试剂-20℃分装保存,可保存4周。避免反复冻融。

产品说明:

PDHEC 4.1.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶,催化丙酮酸脱梭,把糖酵解和三羧酸循环连接起来。

PDH催化丙酮酸脱氢,同时还原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),从而导致605nm光吸收的减少。

Pyruvic Acid + Thiamine Pyrophosphate             Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate

Dichlorophenolindophenol(605nm) + Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate       Reduced Dichlorophenolindophenol

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 组织:称取约 0.1g 组织,加入1mL 试剂一和 10μL试剂二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨,4 ℃ 11000g离心10min,取上清,置冰上待测。

2. 细胞或者细菌样本:先收集500万细胞或细菌到离心管内,离心后弃上清;之后加入1mL试剂一和 10μL试剂二,冰浴超声波破碎细菌(功率200 W,超声3 s,间隔7 s,总时间5 min);然后11000g4℃,离心10 min

取上清置于冰上待测。

3. 血清(浆)及其它液体样本:直接检测。若溶液有浑浊则离心后去上清进行测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至605nm,分光光度计蒸馏水调零。

2、 每个样本需要180μL工作液,根据实验所需取出一定量的工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴锅中水浴10min

3、 空白管:在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水,混匀,立即记录605nm10s吸光值A11min10s后的吸光值A2,计算ΔA空白=A1-A2空白管只需测1-2

4、 测定管:在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL样本,混匀,立即记录605nm10s吸光值A31min10s后的吸光值A4,计算ΔA测定=A3-A4

三、PDH活性计算

a.用微量比色皿测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/mg prot=[(ΔA测定-ΔA空白ε×d×V反总×109]÷(Cpr×V) ÷T

                        =904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/g 质量)=[(ΔA测定-ΔA空白ε×d×V反总×109]÷(V÷V样总×W) ÷T

                        =913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3. 按细菌或细胞数量计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/104 cell=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V样总×500)÷T

                        =1.828×(ΔA测定-ΔA空白)

4. 按样本体积计算

单位的定义:每mL液体在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性U/mL=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷V÷T

=904.762×(ΔA测定-ΔA空白)

   V反总:反应体系总体积,1.9×10-4Lε2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/mol/cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.01mLV样总:加入试剂一和试剂二体积,1.01mLT:反应时间,1minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

b.96孔板测定的计算公式如下

1.按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/mg prot=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T

                        =1809.524×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2.按样本质量计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/g 质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V样总×W) ÷T

                       =1827.62×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3.按细菌或细胞数量计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/104 cell=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V样总×500) ÷T

                        =3.655×(ΔA测定-ΔA空白)

4.按样本体积计算

单位的定义:每mL液体在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性U/mL=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷V÷T

=1809.524×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总:反应体系总体积,1.9×10-4Lε2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L/mol/ cmd96孔板光径,0.5cmV样:加入样本体积,0.01mLV样总:加入试剂一和试剂二体积,1.01mLT:反应时间,1minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项:

1、测定过程中所有样本在冰上放置并于2小时内检测,以免变性和失活。

2、测定管的ΔA值在0.01-0.25之间,若测定管的ΔA值大于0.25,需将样本进行稀释。计算公式中乘以稀释倍数。若测定管的ΔA0.01,需加大样本量后重新测定,注意同步修改计算公式。

3、由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去试剂一的蛋白含量。

实验实例:

1、 0.1g小鼠肝脏加入1mL试剂一和10μL试剂二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨,4℃11000g离心10min,取上清置冰上,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923ΔA空白=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011,按样本质量计算酶活得:

PDH活性(U/g质量)= 913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W=1747 U/g质量。

相关发表文献:

[1] Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Rare ginsenosides ameliorate lipid overload-induced myocardial insulin resistance via modulating metabolic flexibility[J]. Phytomedicine, 2019, 58: 152745.

参考文献:

[1] Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 localizes to mitochondria and enhances pyruvate dehydrogenase activity in skeletal myotubes[J]. Mitochondrion, 2009, 9(4): 266-272.

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应用领域 环保,化工,生物产业,农业,综合
主要用途 丙酮酸脱氢酶活性测定
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