技术文章

组织SPHK1激酶活性光谱法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途

组织SPHK1激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过底物D-苏式-鞘胺醇C-18，在SPHK1激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，受到SPHK1磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析组织裂解样品中SPHK1活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中SPHK1激酶特异活性的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

鞘胺醇激酶（Sphingosine kinase；SPHK1；EC2.7.11.13），属于脂类激酶（lipid kinase）类，包括神经鞘氨醇激酶（ceremide kinase）、二酰甘油激酶（diacylglycerol kinase；DAGK）和磷酸肌醇3激酶（Phosphoinositide 3-kinase；PI3K）等，在原生动物、酵母、植物、哺乳动物等具有进化保留，其中哺乳动物有2个同工酶：SPHK1和SPHK2，SPHK1分子量小，但活性高。SPHK1主要在肺、肝、脾脏等高度表达，而SPHK2主要在肝脏和心脏高度表达。SPHK主要在胞浆里，通过磷酸化鞘胺醇（Sphingosine），产生鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosine-1-phosphate；S-1-P），一种具有强力生物活性的鞘脂类分子（sphingolipids），成为细胞繁殖、分化、运动、存活、免疫细胞活化、钙离子信号通路、细胞骨架重构、发育形态变化等重要的调节性信使分子。由此成为抗炎、抗癌和其它病理条件治疗的重要药物靶标。基于底物D-苏式-鞘胺醇C-18（D-erythro-Sphingosine C-18），在SPHK1激酶敏感性抑制剂SKI5C（2,2-dimethyl-4S-（1-oxo-2-hexadecyn-1-yl）-1,1-dimethylethyl ester-3-oxazolidine carboxylic acid）存在与否的情况下，受到SPHK1激酶的磷酸化，获得产物鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosine-1-phosphate；S-1-P）和ADP，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析鞘胺醇激酶1的特异活性。其反应方式为：

产品内容

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

SPHK1激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

（微型）台式离心机：用于样品预处理

比色皿或96孔板：用于光谱分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光谱分析

实验步骤

• 待测样品准备

• 手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
• （选择步骤）抽去清理液
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过一夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 
• 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
• 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
• 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测
• 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
• 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反应液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入xx微升阴性液（Reagent G）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟 

• 样品总活性测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反应液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入5微升待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白；样品须溶解）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟 

• 样品非特异活性测定

检测开始前，移取xx微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反应液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入20微升上述预处理的待测样品
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

• 计算样品活性

• 样品总活性和非特异活性计算

2）样品特异活性计算

七、酶标仪测定

1）样品总活性测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升底物液（Reagent F）
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克组织裂解悬液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
• 活性计算：

• 样品非特异活性测定

检测开始前，移取xx微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

• 在96孔板上做好相应标记：待测样品
• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反应液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入20微升上述预处理的待测样品
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
• 活性计算：

• 样品特异活性计算

八、抑制剂筛选

• 在96孔板上做好相应标记：背景、*活性和待测抑制剂样品
• 按下表加入试剂，进行样品预处理

• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入20微升上述预处理的待测样品
• 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
• 抑制活性计算：

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
• 样品须澄清，至关重要 
• 如果出现明显的干扰现象，建议使用样本背景对照去除任何内源性干扰因子
• 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
• 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
• 光谱测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 可以使用SPHK1抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照
• 鞘胺醇激酶1活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感