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胰糜蛋白酶的分离纯化

胰蛋白酶在医药、食品、工业和有机合成中具有广泛应用。临床上可用于抗炎症和消化药物的复配；食品加工中用于酒类和饮料的澄清、畜蛋白原的水解、胰蛋白胨的制备和除去乳品在贮藏时氧化产生的味道；工业上用于皮革加工和生丝处理。糜蛋白酶为胰腺分泌的重要蛋白质水解酶，能迅速分解蛋白质，消化溶解变性蛋白质。临床用于多种疾病的治疗，并取得良好效果，如颅内感染性炎症、呼吸系统感染及炎症、消化系统的感染及炎症等。因此，胰糜蛋白酶的纯化研究具有重要的经济和技术意义。

蓝晓科技（股票代码：300487）生命科学事业部致力于开发、生产生物分子分离纯化用层析介质，拥有琼脂糖、葡聚糖、高分子聚合物三种基架的凝胶过滤、离子交换、疏水、亲和等各种层析介质百余种。目前，工业上对于胰糜蛋白酶的纯化，常用离子交换层析介质和亲和层析介质。本次实验针对蓝晓科技生产的seplife^R离子交换层析介质和seplife ^R亲和层析介质进行胰糜蛋白酶的纯化工艺探究。

一．亲和层析工艺

Benzamidine seplife 4FF是蓝晓科技研发生产的一款亲和层析介质，专门用于胰糜蛋白酶的分离。该层析介质对胰蛋白酶有特异性吸附，吸附载量大于35mg/mL，对糜蛋白酶吸附小于3mg/mL，且实验条件对胰糜蛋白酶的活性无影响。

1、 色谱条件：

色谱柱：26*20 ；装柱高度：10 cm；流速：5 ml/min；

    缓冲液A：Tris-HCl + NaCl；

缓冲液B：Tris-HCl；

样品说明：胰糜蛋白酶含量相当，有少量杂质。

2、色谱图

1. 结果分析

分别对原液、流穿液、洗脱液中蛋白浓度和胰糜蛋白酶的效价进行测定。蛋白浓度通过紫外吸收法，效价测定根据中国药典2015年版胰糜蛋白酶的效价测定方法。

中国药典2015年版规定糜蛋白酶的效价不小于1000单位/mg；胰蛋白酶效价不得少于2500单位/mg。由此可以看出蓝晓科技开发生产的Benzamidine seplife 4FF亲和层析介质可以用来生产满足药典要求的胰蛋白酶和糜蛋白酶。

二．离子交换层析工艺

CM Seplife FF是蓝晓科技开发生产的一款弱阳离子交换层析介质，吸附载量可达60mg溶菌酶/mL介质，质量稳定，蛋白活性回收率高。

1．色谱条件：

色谱柱：26*20 ；装柱高度：10 cm；流速：5 ml/min；

    缓冲液A：HAc-NaAc；

缓冲液B：HAc-NaAc + NaCl；

样品说明：客户提供的粗提液，含较多杂质，糜蛋白酶含量高，胰蛋白酶含量低。

2．色谱图

3、结果分析

分别对原液、流穿液、洗脱液1，2，3中蛋白浓度和胰糜蛋白酶的效价进行测定。蛋白浓度通过Bradford法测定，效价根据中国药典2015年版胰糜蛋白酶的效价测定方法。

三．小结

流穿液中全为杂质，洗脱峰一为杂蛋白，洗脱峰二为糜蛋白酶，洗脱峰三为胰蛋白酶。糜蛋白酶效价满足要求的纯化后不少于1200单位/mg。由此可见，CM Seplife FF对胰糜蛋白酶也能达到良好的分离效果，可用于生产满足药典要求的糜蛋白酶。

通过以上实验可以看出，在实际生产过程中，蓝晓科技开发生产的Benzamidine seplife 4FF、CM Seplife FF均可用于胰糜蛋白酶的分离纯化，具体选择要根据样品情况而定。另外，不同的缓冲液体系对分离效果也有影响。（除了Benzamidine seplife 4FF、CM Seplife FF，蓝晓科技开发生产的DEAE Seplife FF也可用于胰糜蛋白酶的分离纯化，该部分内容将于下期继续介绍。）