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许多革兰氏阴性细菌能产生出一套特定的N-acyl-L-homoserine-lactone（AHL）信号分子感应为目的的一种手段,规范在cell-density-dependent协调基因表达方式。从acylated生产AHLs acyl-carrier蛋白（acyl-ACP）和S-adenosyl-L-methionine AHL合成酶的酶。具体的样子AHLs由于大部份的固有的特异性酶acyl-ACP基质的子集。Pantoea结构的研究stewartii酶EsaI和AHL-sensitive生物测定法显示,苏氨酸140在酰基束缚的口袋里的指导酶对生产3-oxo-homoserine lactones。质谱是用于检查范围的AHL产生的分子物种AHL合成酶下的各种条件。一个AHL选择性分离纯化的加法色谱纯化的内部标准AHL deuterated紧随其后的分别是液体reverse-phase chromatography-tandem质谱,为了获得相对量的估计不同的AHLs从生物样品。生产的AHLs野生及工程EsaI AHL合成酶表明,卡和内在的特异性和不同的细胞条件AHLs生产的影响。*百四定位在苏氨酸的EsaI是很重要的偏爱3-oxo-acyl-ACPs,但其作用相当于在卡苏尚不清楚。此外,卡在大肠杆菌产生表示比例高的不寻常的AHLs由与酰基链奇数的碳。此外,这些研究提供额外的方法,将有助于对测量和全身AHLs从不同的来源。

许多革兰氏阴性菌生产acyl-homoserine lactones（AHLs）细胞的一种信号被称作感应”,也就是一般相关的致病或公共的行为（回顾文献39和64）。至少70多种细菌产生AHLs,而从分子链的长度,C4植物酰醇C18。此外,AHLs可以有不同程度的非饱和在C-7或C-8位置,以及氧化在第三的位置（图1）,（15,36岁）。大多数细菌产生一个受限制的范围,AHLs强耦合的选择性AHL自己的检测机械,利用转录监管机构,如我们所知的R-proteins的选择性的结合,是AHL激活或抑制许多下游的靶基因（53 55岁60人）。这一明显的耦合具有导致AHL生产的观念,相对限制在物种信号有别于interspecies信号（21）。

内在的专一是对AHL合成酶acyl-acyl为子集的载体蛋白（acyl-ACP）基体的重要因素AHLs生产特别。合成的细胞中AHLs由AHL合成酶酵素基质是常见的组成部分,acyl-ACP细胞的新陈代谢,S-adenosyl-L-methionine（40条、第46条）。Pantoea stewartii酶的酶EsaI和铜绿假单胞菌3-oxo-C6-homoserine内酯（生产优先卡）,分别3-oxo-C12-HSL好舒（1、48）。这两种酶结构的研究显示一种常见的结合进行acyl-ACP phosphopantetheine假肢集团、建模研究的一个特定的苏氨酸与acyl-chain结合为作为一个重要的氢键的位置3-oxo acyl-ACP（17,62）。此外,比较AHL合成酶序列及其AHLs他们会产生建议苏氨酸,在这一位置与生产3-oxo-HSLs,而丙氨酸和甘氨酸结合unsubstituted和色氨酸的AHLs与生产3-hydroxy-HSLs。AHLs产生的EsaI和苏氨酸140-to-alanine替代变种生物被定义为使用两个敏感的记者,展现一个戏剧性的转变生产AHL在3-oxo-C6-HSL野生型邮寄）在C6-HSL变异（62）。尽管这化验证实残留在作用,为3-oxo-acyl-ACP AHL合成酶特异性,真正的特异性不能使用这个AHL检测方法进行评估。

能被探测到AHLs有效利用生物AHL-sensitive在溶液中或thin-layer-chromatography（TLC）覆盖格式。薄层层析覆盖化验被广泛用于确定种类,所产生的AHLs特定细菌,或说得更具体特定AHL合成酶,因而55）。这些生物分析是灵敏度高、检测能力sub-picomole大量的特定的AHLs。不过,有一个内在检测偏见、因为他们指望特定的特异性为记者应变是用来检测方面AHL Chromobacterium violaceum（37）,农杆菌机理TraR）（55（绿脓杆菌）,或者LasR）（48）。在记者近期发展提供了一定的菌株相对混淆检测系统是认识更为广泛的AHLs（49,66岁）。然而,对已知的*的范围AHLs、多记者株必须装备全套的标准,来评定哪些点对应各具体的信号（7）。

质谱（MS）和气相色谱AHL -MS提供替代方法的检测,该结果是基于物理/化学性能的化合物,如大众/费用比collisionally诱导分子离子,产品离子、和色谱保留性质。Derivatization已经被使用了AHLs的星座考试3-oxo-HSLs用气相色谱-质谱（8）。直接分析已经被报道AHLs采用气相色谱-质谱（6）和液相色谱（HPLC）耦合离子阱质谱（质）（36,41 15,17,43,44,48,59岁）。增加了一个预浓缩措施已经被报道的高度敏感的结果,在AHL检测的方法（13、14）。

作者描述的方法结合起来的一种显示AHLs变化与突变的分布引入两个AHL合成酶,EsaI和卡。根据实验AHLs分布的液体chromatography-electrospray取决于标本ionization-tandem质谱（LC / MS / MS）triple-quadrupole质谱仪使用。我们研究了活性部位的影响的threonines EsaI和卡的特异性的综合,以及AHL贡献目的语文化背景知识的不同的细菌产生的各种各样的AHLs这些AHL合成酶体内。

材料和方法

AHL术语。简短起见,一个酰基链一个具体的长度是由等号前“Cn”为数量的碳在链条,而不是化学名（即是hexanoyl C6）,和替代类型和职位或3-oxo 3-hydroxy（如3-oxo-C6-HSL）。D3表明,AHL包含三个氘原子的位置在终端酰基链。

D3-C6-homoserine内酯的合成。固相carbodiimide,可用于合成化学D3-C6-HSL,使用N-cyclohexylcarbodiimide-N的-propyloxymethyl聚苯乙烯树脂（PS-carbodiimide;Argonaut技术）（12,45）。脂肪酸D3-hexanoic酸（34.5μmol[第4.11章毫克]）（剑桥同位素400加入二氯甲烷的μl（以10%的氮、N-dimethylformamide）在另一个玻璃反应小瓶里。这种反应瓶,40毫克的PS-carbodiimide和混合气添加了点5分钟室温。脂肪酸后,以平衡被允许与树脂的,4.2个毫克（23μmol）——-amino butyrolactone溴酸右美沙芬（HSL-HBr）（奥尔德里奇）溶解在200μl以10%的氮、N-dimethylformamide和4.6μmol 6.4μl）（triethylamine（随后的分析显示没有显著lactonolysis产品时使用triethylamine为基础[数据未显示）,搅拌加入30小时室温。反应包括检查resin-bound基质中滤除耦合/中介,固相萃取如下所述为AHL提取物。D3-C6-HSL的产品是resuspendedzui后在甲醇浓度的200μM。这稀释,体现LC / MS相当于0.2 nmol C6-HSL的,用于所有剩下的实验（见图4B）。

诱变的LasIG质粒。撰写LasIG替换是由pLasIG使用QuikChange诱变方法（Stratagene）为每一个突变互补底漆显示在表1。这些突变经限制,如果可能,分析消化和DNA测序整个基因。

acyl-homoserine lactones的提取和纯化为质谱分析。大肠杆菌株（表1）,而为AHL质粒表达stewartii从第EsaI合成酶和pLasI和pLasIG从铜绿假单胞（18支全垒打,61）,种植在5-ml文化在Luria-Bertani（磅）汤μg / ml的100°C孕37氨苄战兢12到16小时。每一种文化都是1稀释到10毫升的新鲜磅汤100μg / ml氨苄西林和孵化到细胞密度达到一种密度的600海里（OD600 0.6 - 0.8。温度降至25°C,持续15分钟,经过equilibration,每一种文化都引起增加IPTG（异丙——D-thiogalactopyranoside）0.5毫米。培养是孵化为25°C 6 ~ 8小时摇和法。文化的铜绿假单胞种植在同样的方式,除了应变PAO1 PAO214并不需要抗生素和应变与pEX30-las 500μg / ml carbenicillin要求。文化进行处理supernatants在离心10分钟x 3200号,其次是decanting成一个20-ml注射器,通过一个0.2-μm过滤器。在尚未准备样品的定量分析,nmol由0.4添加D3-C6-HSL每10毫升的文化上清收获后但在过滤。提取的文化supernatants两次10毫升的酸性,乙酸乙酯（0.1毫升/升醋酸）,和9个曼梯·里从每个萃取是混合的了,2-ml*干燥在玻璃样品瓶。这提取时间、提取预计至少75%的3-oxo-C6-HSLs。AHLs也取得商业来源（σ,公司法定人数科学）。

初始净化AHL分子物种被了固相萃取。每份样品redissolved,在100μl甲醇（*解,西格玛）,应用于9月启动Pak加上硅墨盒（水,都配有一个6-ml玻璃反应瓶、附在真空在静听着的松林之间。模组,已经被活化6毫升的连续油水各溶剂在以下序列:平等的大量的isooctane和乙醚（乙醚防腐剂不得有简单有效,看成分蛮清爽）,酸性,isooctane乙酸乙酯和乙醚。样品,在甲醇溶剂中添加到5毫升isooctane-ethyl醚,pipetted入反应瓶、然后装到SPE墨盒。固相萃取的洗了两次筒6毫升的isooctane-ether然后eluted到进玻璃杯分数管5 - 8毫升的酸性乙酸乙酯。经过净化的样品被送往干燥采用真空制盐附近,然后移交给一个玻璃autosampler瓶是蒸发*。在redissolved样本50年或100μl甲醇和限定。

/环己烷可以使用的地方isooctane作为溶剂净化手术,但是杂质含量/环己烷reagent-grade了电喷雾离子m / z 284和228个在AHL分析。因此,prepurified /环己烷是在固相萃取才能通过筒之前被用于净化AHLs细胞培养质量。真正的AHLs是被LC / MS / MS在多反应监测（MRM）实验,当基因转移从母体离子两酰基和内酯基重叠峰相比,与已知标准评价色谱保留时间。停留时间分析方法能够区分出C（n）-HSL和3-oxo-C（n-1）-HSL分子物种,也有类似的群众（数据未显示）。

LasR记者的分析方法。LasR记者应变大肠杆菌的MG4 / pKDT17a（48岁,52）是一夜之间就在一个中号（52）,以1毫米MgSO4和100μg / ml氨苄西林30°C。每个萃取1毫升的稀释产业文化（增加到一个OD600 0.1）的5到6小时30°C。威尔森说︰样本来分析-galactosidase活动所使用磨房主分析法（16,38）。

液相色谱。样本LC / MS和LC / MS / MS分析在100 resuspendedμl甲醇和10μl在注射2.0-mm reverse-phase由150.0-mm哥伦布C18柱（Phenomenex）操作在流量达到200μl /分钟废水直接进入质谱仪流动。溶剂一个由水含有0.1%冰醋酸B、溶剂组成的甲醇冰醋酸含有0.1%。一个梯度洗脱方法在5%开始利用溶剂在五分钟,到95%的溶剂B超过30分钟,仍然在95%等静溶剂B,持续15分钟。reequilibrated柱是5分,一个空白的zui终被相互之间进行分析。这梯度优化broad-range检测是降低zui初的有机浓度的制度,但它可以轻易被调整,使之更好的独立,longer-acyl-chain都AHLs短。

质谱法。光谱分析质量进行了API-3000体育Sciex triple-quadrupole串联质谱（Perkin-Elmer生命科学、特霍西尔,安大略,加拿大）。ion-scanning实验前兆进行第三positive-ion模式设置为显示器的m / z此类证券就达到1022和*集扫描大量范围的m / z 50到m / z 400 5秒。该仪器参数如下:离子喷雾电压为4200 V,declustering潜力的潜力,以50 V碰撞200 V,氮是25五、作为碰撞气体。

多个反应监测试验研究了使用相同的液相色谱条件和迈克尔-舒马赫参数前所述。离子的*节和第三监测显示在表2是为每个AHL。这些离子过渡与从母体离子的每一个都AHL基酰[M + H-101]+,以及内酯基在M / z 102（图磅）对于每一种AHLs标识在不断的前兆ion-scanning实验,以及其他AHLs预测要出席。

AHLs的定量分析。标准曲线进行了1-mg / ml股票解AHLs以下各位在甲醇溶剂中:3-oxo-C6-HSL（西格玛）,C6-HSL（Fluka）,C12-HSL（Fluka）。股票解决方案（包括5毫米）,在甲醇产量增加到连续1000,200,浓度40岁,8个,1.6μM。对于每一种分,10μl标准曲线各稀释是加到一autosampler每小瓶含0.4 nmol D3-C6-HSL内部标准的甲醇。标准曲线进行样品MRM使用相同的液相色谱条件和仪器前述参数。测物的峰面积结合使用定量分析软件（Perkin-Elmer 1.2;）。相比产生的标准曲线的比率分析物的区域的山峰和内部标准品量之比分析物的每个标本中的和内部标准（见结果）。每个综合高峰是手动,检查,并对数据进行规范化到内标峰的地区。

结果

想了解AHL合成酶达到这样的高的特异性在AHL信号产品在生产过程中所扮演的角色,我们检测了EsaI和threonines*百四苏卡、144 142比较的AHL野生产品和突变的酶。AHL合成酶活性的测定内在特异性就利用不同的acyl-ACPs为基体的亲和力、公里需要测量值的范围广泛的acyl-ACPs。不仅是难以作出足够数量的acyl-ACPs进行这类学习（26,32岁）,但是它也会有必要了解身份工作,而且还要能够自己作出所有相关的AHLs。虽然AHLs可以进行使用常用的记者应变生物传感器、整体的分析需要多个记者品种和众多的标准来检测和确认许多不同的AHLs。此外,记者株存有偏见为某一特定范围的酰链以及替代在第三的位置。从而更快速、less-biased分析AHL合成酶特异性比可以达成以净化acyl-ACPs或AHL记者生物测定法,我们用质谱研究范围的AHLs由各酶表达了大肠杆菌在多种情况下。

从AHLs的净化质量。分析了产生的AHLs本国或突变也AHL合成酶,这是必须先把信号由这些酶。生产的AHLs革兰氏阴性菌分享homoserine内酯环和容易弥漫或出口的细菌细胞培养上清（30）。由于其固有的特性,AHLs提取细胞培养等有机溶剂上清乙酸乙酯（37）。减轻作业量内酯水解及随后的储存在检查,乙酸乙酯轻微被加上了酸性0.1毫升/升醋酸前55岁,提取65）。另外,AHLs与其他可提取溶剂,如二氯甲烷,这可以提取3-oxo和更有效的3-hydroxy-HSLs比乙酸乙酯、或AHLs获得完整细胞利用卜莱的提取工艺和戴尔脂质（2）。化合物的混合物的有关分子量在这两种情况下是很复杂的,它有帮助净化AHLs污染的油脂和小分子。

固相萃取分离纯化的条件下能分离AHLs杂质基于一种普遍的化学结构,极地的性质的homoserine内酯的戒指。发展的商业AHLs净化协议用乙酸乙酯提取物的大肠杆菌supernatants从细胞表达文化AHL合成酶的酶。薄层色谱分离纯化的优化分析方法对固相萃取溶剂系统,3-oxo-C12-HSL纯化3-oxo-C6-HSL乙酸乙酯萃取物,100-ml的LasIG文化。LasR记者的生物被用来跟踪洗脱的信号,AHL,如图2。乙酸乙酯洗脱已恢复输入信号,这是满足这一分析的,因为一个内部标准能纠正任何损失从生产,不能再进一步的重大损失AHL已见用固相萃取技术的清洗步骤。这个过程消除了之前需要完成薄层色谱分析质量,减少了光谱分析样品的复杂性,要检查AHLs集中。