Megazyme 比色法用低聚糖 FAQs （1）

Q: 4-硝基苯糖苷酶底物如何应用于比色法测定酶活性？

A: 酶溶液稀释: 将酶制剂稀释到适当的分析缓冲液中(100 mM 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白，在酶经检测*pH范围内)。初始的1:100稀释液置于一个 100 mL容量瓶中，随后加入10倍的稀释液以获得合适的酶溶液浓度。40摄氏度下，水浴加热酶稀释液5分钟进行预培养。

加底物: 0.2 mL pNP底物 (10 mM)分别加入8个玻璃试管中(4个时间点的重复样本)，40摄氏度水浴培养5分钟。

酶反应: 0.2 mL酶(按步骤 4.23制备)分别加入含有底物的玻璃试管中，涡旋混合，并在40度水浴中培养重复样本3，6，9，和12分钟。在培养接近终点时，加入3.0 mL 2% 磷酸三钠溶液以终止反应，并立即快速涡旋混合。

反应空白样: 将3.0 mL 2% 磷酸三钠加入2个玻璃试管中，然后加入0.2 mLpNP-底物 (10 mM)并涡旋混合，接着分别加入0.2 mL酶到2个试管中并立即涡旋混合。在室温下培养。

在400nm下检测所有样品的吸光度

用水为分光光度计归零。

检测两个空白样 (记录数值，然后根据其一将分光光度计归零 – 设定这两个值很接近).

检测其余样品的吸光度

根据吸光度和培养时间绘制吸光度曲线，并将结果用于计算。

计算:

1个单位酶活性，是每分钟在*pH和40摄氏度下将1微摩尔PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的数量。

按以下公式进行计算:

U/mL = (A400 /按分钟计的反应时间) x (按毫升计的总反应体积 / 按毫升计的酶溶液体积) x (1 / pNP的消光系数) x 酶稀释因子

U/mL = (A400 / 分钟) x (3.4 mL / 0.2 mL) x (1 / 18.1) x 稀释因子

在这里:

A400/min = 吸光值 (反应)/分钟 – 吸光值 (空白)/分钟.

培养时间 = 10 min.

细胞总体积 = 3.4 mL

分析的等分体积 = 0.2 mL

2% 磷酸三钠中pNP的消光系数 = 18.1

该计算设定,在记录吸光度变化的整个10分钟反应期内，反应速率呈线性分布。如果实际情况并非如此，则使用zui高反应速率来替代2-10分钟时间内记录的速率