上期谈到了“蛋白质浓度测定常用的三种方法”，今天继续就这话题详解另一种蛋白定量的方法--Bradford 法，至于选用哪种方法，可以根据实验室的条件和个人喜好来选！做实验前我们先了解一下实验原理，如下：
BCA法实验原理：碱性条件下，蛋白质分子中的肽键结构能与Cu2+结合生成紫色络合物，同时将Cu2+还原为Cu+。BCA试剂可灵敏特异的与Cu+结合，形成稳定的有颜色的络合物，562nm处有高的吸收值，可在540-595nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
Bradford 法实验原理：考马斯亮蓝G250,在游离状态下呈红色，大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。
快速测蛋白法
要想加快速度好是选用 Bradford 法了，这是为什么呢？看Abbkine蛋白质定量试剂盒（Bradford法）优点就知道了：
" 节省时间—显色反应迅速
" 兼容性好—不受大多数化学物质的影响。对于样品中巯基乙醇和二硫苏糖醇的兼容浓度，分别可达1mM和5mM。
" 良好的检测范围—检测范围为50 - 1000ug/ml。
下图就是用 Bradford 法测出的标准曲线。虽然线性拟合不佳，但是二项式吻合度却非常高，可以说非常了。
下图展示了如何在 excel 中制作二项式标准曲线。
到此为止，前面我们担心的几个问题就已经全部解决了。，担心 Triton 或 SDS 的影响，我们用去垢剂兼容性的 Bradford 试剂即可。第二，担心标准曲线不佳，我们用二项式来拟合即可。
下面我们继续利用 excel 的自动化功能进一步提升计算速度。首先，初中的时候大家就学过，解二项式的公式是：
这条曲线是一条开口向下的抛物线，所以取 x 轴上的较小的值就是我们所要的浓度值。为了简单易用，我们可以先命名几个单元格为 background，a，b，c，从酶标仪读取 OD 值之后填入 background，复制标准曲线的光密度值，填入 excel 给出的方程中的 a，b，c 之后，excel 就能自动减去背景计算出浓度了。
整个过程熟练的话 1 分钟足矣，操作的同学 2 分钟也就足够了。俗话说好马配好鞍，快速 WB 需得配合快速蛋白定量方能有一气呵成、唯快不破的痛快淋漓。但是，使用这种方法需要注意的几个问题：
注意要点
1. 蛋白浓度不能太高，如果超过了标准曲线的范围（比如 OD>2），那就测量不准了。不仅是本方法，所有基于浓度标准曲线的方法都是如此，比如 ELISA。当然也不能太低了。
2. 大约 10 年前就有文献报道测量双波长，即 A595 和 A450 的比值能够获得良好的线性关系并提高灵敏度，这种方法我试过了，在 0.125-1.5 mg/ml 的范围内准确性不如二项式曲线拟合高。
3. 另外，标准品有可能发生降解导致浓度不准确，建议每次测量时加入一个已知浓度的样本作为校验。我每次都会加入一个 0.1-0.5 mg/ml 的 BSA 标准品，校验一下曲线是否准确。
4.加入标准品的时候枪头一定不能有残留，否则容易引起较大误差，建议初学者刚开始时做 2 到 3 个标准品复孔。
5.Bradford 法加完样之后需立刻马上测量，OD 值能稳定保持 10 分钟左右，如果不能马上测量，建议换用 BCA 法。
6. 大招：如果你已经是老司机了，还有个方法不用测蛋白浓度，只要在显微镜下估测各组细胞密度差不多，直接提蛋白变性上样跑 WB 即可。但老司机也有翻车的时候，请慎用。
