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胃蛋白酶试剂盒的实验原理与操作步骤及应用！

一、背景

胃蛋白酶试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人胃蛋白酶的含量。

二、实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被胃蛋白酶捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胃蛋白酶呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

三、样本处理及要求

1、血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

四、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

五、实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

六、应用

用于唾液胃蛋白酶检测对胃食管反流病的诊断价值研究：

对清晨刚醒时与三餐后1小时唾液胃蛋白酶浓度对胃食管反流病的诊断价值进行比较。

研究方法：采用前瞻性病例对照研究,纳入108例胃食管反流病患者作为病例组及32例健康志愿者作为对照组,令所有受试者完成胃镜检查。病例组根据内镜下有无糜烂性食管炎分为糜烂性食管炎亚组（50例）和非糜烂性反流病亚组（58例）。收集个人资料,采集唾液样本。

应用酶联免疫吸附法测定清晨刚醒时及三餐后1小时唾液胃蛋白酶浓度。

结果：胃食管反流组唾液胃蛋白酶浓度明显高于健康对照组（88.26ng/ml vs10.81ng/ml,P<0.001）。非糜烂性反流病亚组唾液胃蛋白酶浓度低于糜烂性食管炎亚组（80.51ng/ml vs 94.06ng/ml）。胃食管反流组清晨刚醒时唾液胃蛋白酶浓度明显高于三餐后1小时（P<0.05）,三餐后1小时唾液胃蛋白酶浓度分布无明显差异。糜烂性食管炎及非糜烂性反流病亚组清晨刚醒时胃蛋白酶浓度明显高于三餐后1小时（P<0.05）,三餐后1小时唾液胃蛋白酶浓度分布无明显差异。以清晨刚醒时样本胃蛋白酶浓度做出受试者工作曲线发现,唾液胃蛋白酶诊断阈值为53.76ng/ml,曲线下面积为0.995,敏感度为95.4%,特异度为,尤登指数为0.95。

当以早餐后样本为分析对象时,诊断阈值浓度为54.56ng/ml,曲线下面积为0.967,灵敏度为86.1%,特异度为,尤登指数为0.86。当以午餐后样本为分析对象时,诊断阈值浓度为28.26ng/ml,曲线下面积为0.979,灵敏度为95.4%,特异度为90.6%,尤登指数为0.86。当以晚餐后样本为分析对象时,诊断阈值浓度为19.81ng/ml,曲线下面积为0.979,灵敏度为98.1%,特异度为87.5%,尤登指数为0.86。由此可见,清晨刚醒时采样的诊断价值。

结论：唾液胃蛋白酶检测对胃食管反流病的诊断具有重要意义,并且具有高效、简便、易于接受等优势,有望成为胃食管反流病的重要诊断工具。清晨刚醒时作为唾液胃蛋白酶检测采样时间较三餐后1小时更为合适。