1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2、取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3、去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；
4、离心1000rpm，5min；
5、去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6、细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7、在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
注意事项
1、从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞用于冻存，最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2、将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3、冻存和复苏最好用新配制的培养液。
