1.消毒物品的初步处理，凡接触过病原微生物的医疗器械、被单、衣物等均应先用化学消毒剂进行消毒。常规清洗时，先用洗涤剂溶液浸泡擦洗，去除物品上的油污、血垢等污物，然后用流水冲净。有轴节、齿槽和缝隙的器械和其它物品，应尽可能张开或拆卸，进行洗刷。洗涤后的物品应擦干，按临床需要分类包装，以免再污染。清除污染前后物品的容器和运送工具应严格区分，以防交叉感染。
3.消毒物品装放应合理，尽量将同类物品装在同一锅内灭菌。物品装放时，上下左右均应交叉错开，留出缝隙，使蒸汽容易穿透。大消毒包应立着放上层，小包放下层，布类和金属类物品同时灭菌时，应将金属类物品包放在下层，使两者受热基本一致，并防止金属物品灭菌中产生的冷凝水弄湿包布。
4.排尽空气，使用高压蒸汽灭菌器时，最关键的是将锅内空气排尽。关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力到指ding的时间。
5.合理计算灭菌时间，穿透时间，从锅内达到灭菌温度开始到锅内最难达到的部位也达到此温度所需要的时间；维持时间，即杀灭微生物所需要的时间，一般以杀灭嗜热脂肪杆菌芽胞所需时间来表示；安全时间，为使灭菌得到确切保证所需要增加的时间，一般为热死亡时间的一半，其长短视消毒物品而定。
6.开盖操作，达到灭菌时间后即可切断电源，在压力降到0.05MPa，可缓慢放出蒸气，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后才能开盖，取出培养基摆在平台上以待冷凝，不可久不放气，否则容易引起培养基成分变化以至无法制作斜面培养基。
7.灭菌后操作，要求消毒物品干燥后检查指示剂，当达到灭菌要求时可出锅。取无菌物品时，要严格无菌操作，开盖物品先将盖盖好，贮槽关闭好通气孔。同时应分类放置，顺序发放取用。
8.防止超热蒸汽，超热蒸汽温度虽高，但像空气一样，遇到消毒物品时不能凝成水，不能释放潜热，所以对灭菌不利。防止超热的办法是使用外源蒸汽灭菌器时，不要使夹层的温度高于消毒室的温度，两者应相近不要使压力过高的蒸汽进入消毒室内；灭菌时不要先用压力高的蒸汽加热到要求温度，然后再降至正常压力。
9.高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。
10.含有盐分的液体漏出或溢出时，一定要及时擦干净，沿着盖子的密封圈要擦干，否则会腐蚀容器和管道。
11.不要在爆炸性气体附近使用仪器。
