摘要本文阐述了用于柴胡分析的传统 HPLC 和高分离度快速液相色谱（RRLC）方法的开发。对不同柴胡样品指纹图谱的比较显示了不同产地采集的中药具有不同的色谱峰形。优化了 Agilent 1200 系列蒸发光散射检测器的方法参数，可得到最大的响应值。开发了测定不同中药及其制剂中六种柴胡皂苷含量的定量方法。
前言柴胡为伞形科植物北柴胡（BupleurumChinese DC） 或 狭 叶 柴胡（ B.scorzonerifolium）的干燥根，是最为常用的中药材之一。参照《中国药典》1，B.Chinese DC 和 B. scorzonerifolium （伞形科）分别习称为“北柴胡”和“南柴胡”。除了北柴胡与南柴胡，中国还有其他药材品种以柴胡入药。许多的中成药复方制剂中用到柴胡，它可以用于治疗感冒发热。柴胡中含有多种成分，其中柴胡皂苷被认为与治疗作用关系最大。曾有报道使用HPLC 以紫外检测器在 210 nm 以下的低波长处对多种柴胡中的柴胡皂苷进行测定。使用甲醇等有机溶剂进行梯度洗脱时，以如此低的检测波长不可能得到平稳的基线。基线的漂移可能对定量分析产生影响，因为色谱峰可能无法得到正确的积分。柴胡中的一些柴胡皂苷是多萜类皂苷，仅在低波长处具有紫外吸收。另一些柴胡皂苷具有二烯结构，因此较易进行紫外检测。在柴胡的切片或 HPLC 样品制备过程中当处于高温和低 pH 条件时，多萜类皂苷不稳定，易转化为二烯结构。
LC/MS 也已用于柴胡的研究，其检测限更低，灵敏度更高，但是仪器设备较为昂贵，而且要求操作人员具备质谱知识。目前，趋向于使用蒸发光散射检测器（ELSD）分析柴胡，在中国的科学期刊上已有多篇论文发表 2,3。ELSD 可用于检测所有比溶剂挥发性小的被分析物，能够保持平稳的基线，而与溶剂的紫外吸收或梯度条件无关。柴胡皂苷含有 1 个或 2 个双键，在 ELSD 上的信号没有差别。一些在低波长处有紫外吸收的挥发性组分，使用ELSD 时没有响应，因此在对柴胡皂苷进行定量分析时不会对积分产生干扰。柴胡的指纹图谱对于鉴定其产地非常重要。柴胡中除了柴胡皂苷以外的其他成分也对治疗作用具有不同的贡献。为获得柴胡的全面信息，应同时使用 UV 检测器和ELSD 以检测柴胡皂苷和其他成分的色谱峰。
根据参考文献，传统 HPLC 方法分离几种柴胡皂苷需要 50 分钟。为加速分析进程，RRLC 越来越引起人们的关注。RRLC 在保持分析性能的同时，可以缩短运行时间并降低成本。本文中同时应用了两种方法，对不同的液相色谱系统配置给出参考。对不同样品得到的不同谱图进行了讨论，同时，定量分析结果显示不同样品中柴胡皂苷的含量也有差异。
实验部分标样和试验材料6''-乙酰基-SSa (3)、3''-乙酰基-SSd (5) 和6''-乙酰基-SSd (6) 是在实验室中从中药柴胡的根部分离得到。SSa (2) 和 SSd (4) 购自中国药品生物制品检定所（中国北京）。SSc (1) 购自中药固体制剂国家研究中心（中国江西）。通过光谱数据（UV、MS、1HNMR 和 13C NMR）与文献值的比较，对这些化合物的结构进行解析。研究用原料药材由研究组成员收集而得。
仪器一台 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统同时用于传统 HPLC 和 RRLC 方法的开发。该系统包含以下模块：• Agilent 1200 系列 SL 型双泵，带真空脱气机• Agilent 1200 系列 SL 型高效自动进样器• Agilent 1200 系列 SL 型柱温箱• Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检测器，具备微量流通池（容量 2 µL，光程3 mm）• Agilent 1200 系列蒸发光散射检测器，带标准喷雾器• Agilent ChemStation，软件版本 B.03.02，用于仪器控制、数据采集和评价
图 2 显示了使用 RRLC 方法的分析结果，运行时间由 60 分钟缩短为 6 分钟。色谱图基线平稳，而且色谱峰分离良好。洗脱顺序与传统 HPLC 方法一致，因为两种色谱柱使用了同一种键合类型的填料
参照《中国药典》，锥叶柴胡（25 号样品）并非典型的柴胡。然而，实际上一些老中医仍然使用这种柴胡。图 3 为 ELSD 和UV 检测所得色谱图。与典型柴胡相比，25 号样品的 HPLC 谱图中有更多的色谱峰。通过比较 ELSD 和 UV 信号，两类色谱峰能够得到识别。这证明 ELSD 和 UV检测器因为能够检测不同种类的化合物而具有互补作用。第一类色谱峰中化合物的挥发性比溶剂强，并且含有发色团。第二类色谱峰中化合物的挥发性较溶剂弱，且不含发色团。这些色谱峰的化合物结构仍然未知。将这些结果与药理学研究相结合，能够揭示是否这些色谱峰中的化合物具有治疗作用。
