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pcr电泳条带图的解读方法

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2023/4/16 13:17:43

pcr电泳条带图的解读方法的探究 首先要从PCR的扩增原理说起:今天小编为您分析归纳,希望对您有用

PCR的原理:PCR的基本过程类似于DNA的天然复制,特异性依赖于与靶序列两端互补的Oligo引物。整个过程由变性-退火-延伸3个基本反应步骤构成:

  1,模板DNA变性:模板或经PCR扩增形成的DNA经加热至94℃左右一定时间后,双链之间氢键断裂,双股螺旋解链,变成两条单链,以便它与引物结合,为下一轮反应做准备。

  2,模板DNA与引物的退火(复性):DNA加热变性成单链后,当温度降至一定程度(55℃左右)时,引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合。

  3,引物的延伸(72℃):在Taq DNA聚合酶的作用下,DNA模板上的引物以dNTP为原料,按A-T、C-G碱基配对与半保留复制原则,合成一条新的与模板DNA链互补的链。

  重复上述 变性-退火-延伸 的循环过程,每一循环获得的“半保留复制链”都可成为下次循环的模板。通常每完成一个循环需时为2~4min,2~3h就能将靶核酸扩增放大上亿倍(30个循环时,靶产物数量约为10亿)。(注:PCR的第1和第2个循环,并没有短的目的片段,只是在第3个循环后才有,并且有部分双链的长片段将始终伴随整个扩增过程)

下面结合具体事例分析

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PCR电泳法应用实例介绍

  比如现在有一名高血压患者,我现在要做高血压个性化用药基因检测(点击查看),拟选择卡托普利进行降压,那么需要对ACE I/D突变进行检测。经过引物设计(点击查看),最终的野生型目的片段约在200bp左右,由于突变型的目的片段比野生型的多了287bp的插入,那么突变型的片段约在500bp左右。

ACE I/D 16号内含子中存在的287bp插入

  DNA经过PCR的扩增后,我们对扩增的产物进行电泳检测,DNA凝胶电泳所需的标准琼脂糖浓度一般为1.0%。浓度越高,小条带的分辨率越高;反之,琼脂糖浓度越低,大分子量条带的分辨率和分离程度越高。

  在电场中,中性pH值缓冲液(TAE/TBE)下DNA都带净负电荷并向凝胶装置正极(+)方向移动(下图中,上为“-极”至下为“+极”),DNA分子越大则所受阻力越大,也越难在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢,比如500bp的DNA分子比200bp的DNA分子迁移就慢。

  此外,电泳时需要将DNA与荧光染料混匀,结合染料后,DNA会在紫外灯下发出荧光,这样才会出现下图中的亮色条带,常用的染料有EB(溴化乙啶)、gel red、sybrgreen1等(有钱建议不要用EB,因为有毒)。

  在电泳结束后进行结果解读,我们无法直接判断DNA的长度,所以需要在电泳过程将DNA产物与DNA标准品(DNA Marker)一起跑电泳,DNA Marker里面含有若干种长度已知的DNA(下图中出现6条亮带的就是DNA Marker),通过与之比较可以粗略判断DNA样品的长度。同时DNA Marker中的DNA片段浓度已知,通过与DNA Marker的亮度进行比较也能初步判断DNA样品的浓度。

  结果解读:通过与DNA Marker比较,如果是野生型,那么就是左边这个图,可发现DNA片段长度大小约为200bp,如果是突变型,那么就是右边这个图,突变有纯合突变和杂合突变两种,中间一条500bp的条带即为纯合突变,最右边的200bp及500bp两条条带即为杂合突变,通过PCR及简单的电泳法便可准确的进行ACE I/D的检测。

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