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双染法免疫荧光组织化学染色步骤

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2023/8/8 11:21:52

如果同一标本中需要同时显示A、B两种抗原,则A抗原的抗体用FITC标记,B抗原的抗体用TRITC标记,可采用以下染色方法用过的:

免疫荧光细胞化学双染

原代培养的大鼠端脑细胞第14天胚胎:在成骨形态蛋白的诱导下,乙酰胆碱转移酶(绿色荧光)和同源结构域蛋白Islet-1(红色荧光)共存于细胞质中(激光扫描共存)。聚焦显微镜观察)

1.一步双染法,将两种荧光标记抗体按适当比例(A+B)混合,按照直接法进行染色。

2.两步双染法,先用TRITC标记的抗体A进行免疫荧光染色,然后用FITC标记的抗体B进行免疫荧光染色。根据两种抗体的动物种类,可以采用直接法或间接法结果是A抗原呈橙红色荧光,而B抗原呈黄绿色荧光。在应用中,常用的方法是免疫荧光组织化学中的间接法与荧光染料SABC-Cy3法的结合。例如,在实验设计中,选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗,匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化抗兔。免疫球蛋白G。

进行双染时,由于两种一抗来源不同,可能会混合一抗。孵育后,清洗未结合的一抗。滴加二抗时,先加入人生物素化抗兔IgG(二抗)孵育。清洗后,滴下 SABC-Cy3 复合物。特异性荧光,然后与FITC-抗小鼠IgG(二抗)孵育,最后封片观察。结果,A抗原显示绿色荧光,B抗原显示红色荧光。

该方法中需要注意的是,两种一抗混合稀释时,抗体的终浓度应为每种抗体的工作浓度。也就是说,混合液要同时满足两种一抗的工作浓度。如果两个一抗来自同一物种,则必须进行两次双染,即A抗原先用第一个一抗和第一个荧光二抗染色,然后用第二个一抗和第一个荧光二抗洗涤荧光二抗。 B抗原染色需使用两种荧光二抗,否则会发生交叉反应,导致染色不特异。


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