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电转百科指南⑤:CRISPR基因编辑的转染技巧与注意事项(上篇)

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2023/10/26 18:09:14

电转百科指南①:如何提高电转染效率?技术专家总结以下八点!

电转百科指南②:不同细胞的电转技巧,收藏了慢慢看!

电转百科指南③:手把手教程来了,20种常用细胞的实验方案

电转百科指南④:每日问候你的细胞转染结果好吗,支原体污染要避免


本周第五期电转百科我们将更进一步,为大家带来CRISPR基因编辑的内容,本章内容将分为Knock-out与Knock-in上下篇,请继续关注下一期的后续!

01/上篇

Knock-out

Lonza Nucleofector™核转染系统可以广泛应用于多种不同的场景,在不同的应用场景下通常会使用DNA或RNA或蛋白进行外源基因的递送,以实现特殊的应用需求。



以CRISPR系统为例,全球有大量的客户使用Lonza Nucleofector™核转染系统开展基于CRISPR系统的基因编辑相关工作并发表文章且逐年递增。



▲ Google Scholar Search for ‘Nucleofector CRISPR’, July 2023

· 对于CRISPR的转染,即可以通过表达Cas9的质粒系统如PX458载体来实现“剪刀” Cas9的递送,也可以通过Cas9 mRNA的方式在细胞质中直接翻译,与sgRNA形成复合物后再进入细胞核进行基因组编辑。当然我们也可以在转染前提前将Cas9蛋白与sgRNA进行孵育形成RNP复合物,再通过电转染递送到细胞内,直接进入细胞核进行基因组编辑。



· 对于CRISPR应用,主要用于knock-out或Knock-in

Knock Out:尽管Knock-out已经比较容易实现高效的敲除效率,但对于陌生的细胞或者全新的位点依然需要进行适当的调整。包括但不限于以下方面:

不同的Nucleofection条件测试

Lonza为多种常用的细胞提供预优化的电转程序,电转程序与细胞相关,通常来说,即使电转不同的核酸底物(DNA,RNA,蛋白等)无需对电转程序进行调整,但在越来越多的原代细胞转染中,使用RNA或RNP进行细胞基因编辑时,可以通过对程序进行适当的微调,以获得更高编辑效率的同时,更好的维持细胞的活率及功能。对于常见的T cell,HSPC,NK,DC等免疫细胞可以对Nucleofection脉冲条件进行适当调整。



▲ Akiko Seki et al., 2018

不同的crRNA/sgRNA测试

对于同一基因不同的sgRNA表现可能不同,目前已有大量设计sgRNA序列的工具,部分工具也可以为其打分,但通常还是建议尽可能测试多个sgRNA以确保实验结果。甚至结合多条sgRNA对同一基因进行编辑。



▲ Akiko Seki et al., 2018

不同Cas9蛋白的测试

对于不同供应商的Cas9蛋白也存在切割活性的差异,对于WT Cas9和一些经过优化的Cas9蛋白也会导致编辑效率的差异。



▲ Akiko Seki et al., 2018



▲ Liyang Zhang et al., 2021

Cas9用量测试

除对不同Cas9蛋白来源的测试外,Cas9的用量也是需要在试验优化中考量的因素。



▲ Liyang Zhang et al., 2021

Cas9:sgRNA比例测试

对于Cas9蛋白和sgRNA形成的蛋白复合物,以何种比例添加进行孵育转染必定也是重要的因素。在大多数的出版物中,Cas9:gRNA的比值在1:1.2 - 1:5之间。



▲ Akiko Seki et al., 2018

Electroporation Enhancer

有时可以考虑使用electroporation enhancer以实现更高的编辑效率。



▲ Matteo Martufi et al., 2019

市面上大多数提供Cas蛋白或sgRNA的供应商通常也会提供一份详细的protocol,可以优先参考这些protocol或相关的paper。除上面提到的方向外,供体差异,转染的时间点,对于免疫细胞(如T细胞),何种激活剂激活也可能会对最终的结果造成影响。


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