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【瑞士步琦】使用Sepmatix 8x SFC进行高效色谱柱筛选

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2023/11/14 14:22:41

高效色谱柱筛选

 

尿嘧啶和黄嘌呤,即咖啡因、可可碱和茶碱,是一组在各种生物过程和人类消费中起重要作用的有机化合物[1-3]。这些分子属于杂环化合物,其特点是含有碳原子和氮原子的环状结构。尿嘧啶是 RNA(核糖核酸)的基本组成部分,RNA 是形成遗传密码并参与蛋白质合成的基本核碱基之一。另一方面,黄嘌呤、咖啡因、可可碱和茶碱是一类结构相似但生物效应不同的生物碱[1-3]。这些黄嘌呤存在于各种植物中,是一种众所周知的兴奋剂,可以穿过血脑屏障,影响中枢神经系统。在 RP(反相色谱)[1-3]条件下(SN_802_2023), LC(液相色谱)可分离生物碱。

 

超临界流体色谱(SFC)是一种使用超临界二氧化碳(CO2)作为流动相的基本成分的色谱技术。这种状态的二氧化碳被称为超临界,它具有独特的特性,如高扩散系数和低粘度,使其成为分离和分析化合物的绝佳溶剂。与传统色谱方法相比,SFC 提供了许多优势,包括更快的分析时间,更低的溶剂消耗和分离的差异选择性。此外,与 RP-LC 相比,SFC 代表了一种正交技术,为各种分析挑战提供了互补的分离能力。

 

在 SFC 中,色谱柱筛选包括测试不同的固定相,以找到最适合特定分离任务的固定相。固定相是色谱系统的重要组成部分,因为它直接影响色谱的选择性。不同的固定相具有不同的化学功能和与分析物的相互作用,使它们或多或少地选择特定的化合物。通过筛选和选择合适的色谱柱,可以优化分离条件,以获得更好的目标分析物的分辨率和灵敏度。

 

本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 仪器对尿嘧啶、咖啡因、可可碱和茶碱混合物进行平行柱筛选,随后转移到制备的 Sepiatec SFC-50。

 

1

设备

  • Sepiatec SFC-50 instrument

  • Sepmatix 8x SFC instrument

  • PrepPure Silica, 5μm, 250 x 10mm

  • PrepPure Diol, 5μm, 250 x 10mm

  • PrepPure Silica, 5μm, 250 x 4.6mm

  • PrepPure Diol, 5μm, 250 x 4.6mm

  • PrepPure Amino, 5μm, 250 x 4.6mm

  • PrepPure 2-EP, 5μm, 250 x 4.6mm

  • Reprosil 4-EP, 5μm, 250 x 4.6mm (Dr. Maisch GmbH)

  • PrepPure PEI, 5μm, 250 x 4.6mm

  • PrepPure CBD, 5μm, 250 x 4.6mm

  • Cyano, 5μm, 250 x 4.6mm, (Dr. Maisch GmbH)

 

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试剂和材料

  • 二氧化碳(99.9%)

  • 甲醇(≥99%)

  • 尿嘧啶(99% + %)

  • 可可素(99%)

  • 咖啡(99%以上)

  • 茶碱(99%)

 

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实验

样品制备:

在 50/2.5mL 甲醇/水混合液中,40℃ 下用超声水浴溶解 0.05g 尿嘧啶,0.07g 咖啡因,0.055g 可可碱,0.085g 茶碱。

 

Sepmatix 8x SFC 筛选运行条件:

流动相:A =二氧化碳:甲醇

流速:3ml /min(每柱)

流动相条件:

0-0.5min:5% B

0.5-8.0min:5 - 50%

8.0-9.4min:50%

9.4-9.5min:50 - 5%

9.5-10min:5% B

检测:紫外扫描波段:200nm - 600nm

 

筛选运行是自动开始的。使用流量控制单元将流量设置为每通道 3mL/min,并平衡色谱柱。自动进样(V=5 μL),开始平行筛选(运行时间=10min)。背压调节器设置为 150bar,柱箱加热至 32°C。

 

SFC-50 运行条件:

流动相:A =二氧化碳;B=甲醇

流动相条件:等度运行条件

检测:紫外波长 270nm

 

SFC 柱在规定的流速下条件预热 3 分钟,使用定量环自动注入样品并开始运行。背压调节器设置为 150bar,柱箱加热至 40°C。

 

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结果与讨论

用 Sepmatix 8x SFC 筛选色谱柱:

为了确定样品的最佳分离选择性,进行了不同色谱柱的筛选。使用 Sepmatix 8x SFC 仪器可以高效地同时筛选8个色谱柱。因此,最佳选择性可以在很短的时间内确定。为此,使用了 8 种不同的固定相:硅胶、二醇基、氨基、氰基、2-EP、4-EP、PEI 和 CBD,图1显示了筛选的结果。

 

图1:Sepmatix 8x SFC 仪器筛选结果。从左到右依次为:硅胶、氨基、氰基、二醇基;下从左至右依次为:2-EP、4-EP、PEI、CBD 柱;运行时间=10分钟

 

用分辨率(R)来衡量色谱方法在色谱图中分离和区分两个相邻峰的能力,它量化了分析物相互分离的程度。表 1 显示了 4 组分分离的分辨率值。使用 Sepmatix 软件和以下公式自动确定:

 

 

  • 其中tR1 和 tR2 代表 组分 1 或组分 2 的保留时间

  • W1 和W2 代表分量1或分量 2 峰高一半处的宽度

 

在处理复杂的混合物时,分辨率尤其重要,因为它确保每个分析物都被很好地分离,并且可以准确地识别和定量。分辨率为 1 表示峰值根本没有被分解,基本上是合并的,而更高的分辨率值表示峰值之间的分离更好。在使用过程中,分辨率至少应达到 1.5,才能以适当的定量和鉴定分析物。

 

色谱柱

R1

R2

R3

硅胶

1.57

4.18

3.79

氨基

5.42

1.26

4.44

氰基

未分离

3.35

1.69

二醇

3.92

5.1

2.29

2-EP

3.62

2.72

未分离

4-EP

9.46

2.87

未分离

PEI

9.93

1.86

10.8

CBD

5.01

1.27

4.51

表1:SFC 不同筛选条件下的分辨率值

 

R 值的筛选和评价表明,硅胶、二醇基和 PEI 相对样品的分离选择性最好。二醇基在运行时间和分辨率方面表现出最佳性能。硅胶柱上的分离并不完全是茶碱和咖啡因的基线分离。PEI 相的运行时间相对较长,因为样品分子的位阻较大。表 2 为洗脱顺序,这是通过测定的光谱和组分的单独进样来确定的。与其他相相比,硅胶显示出不同的洗脱顺序。对于氰基、2-EP 和 4-EP,不能完全确定洗脱顺序。

 

色谱柱

洗脱顺序

硅胶

茶碱,咖啡因,尿嘧啶,可可碱

氨基

咖啡因,茶碱,可可碱,尿嘧啶

氰基

咖啡因和茶碱的双峰,可可碱,尿嘧啶

二醇

咖啡因,茶碱,可可碱,尿嘧啶

2-EP

咖啡因,茶碱,可可碱和尿嘧啶的双峰

4-EP

咖啡因,茶碱,可可碱和尿嘧啶的双峰

PEI

咖啡因,茶碱,可可碱,尿嘧啶

CBD

咖啡因,茶碱,可可碱,尿嘧啶

表2:SFC 不同色谱柱筛选条件下的洗脱顺序

 

将开发方法通过 SFC-50 放大:

由于二醇基取得了最好的结果,因此选择了 5μm, 250 x 10mm 的 PrepPure 二醇基进行 Sepiatec SFC-50 方法放大制备。由于通过堆叠注射法纯化混合物的效率明显高于多次梯度注射法,该方法是在等度运行条件下实施的,这是使用堆叠进样的要求。在等度条件下,样品只能在低甲醇含量下分离(见图2,下)。在高甲醇浓度下,由于流动相的高洗脱强度,尿嘧啶、咖啡因、茶碱和茶碱是不可分离的(见图2,上)。

 

图2:使用 PrepPure Diol 5 μm, 250 x 10mm 色谱柱分离样品。上:流速= 20 mL/min, 150 bar, 40℃,270nm, 33% B,进样量= 0.09 mL,运行时间= 4 min;下:流量= 20 mL/min 150 bar 40°C, 270 nm, 12%甲醇,0.09 mL,运行时间= 5 min

 

改变压力和温度可以优化分辨率。最佳分离条件为 40℃ 和 150bar。

 

图 3 为图 2(下)实验条件下的堆叠进样情况,堆叠时间为 2.42min,因此每 2.42min 进样一次。在这种情况下,由于每次额外注入节省了平衡时间,因此提高了产能。

 

为了更有效的多次分离,可以使用硅胶填料。使用 34% 的甲醇作为改性剂,将堆叠时间缩短至 2.15min。与二醇基相比,硅胶填料在 100bar 下表现出更好的性能。然而,在 1.5 的分辨率下,咖啡因和茶碱并不能获得理想的基线分离。由于硅胶的极性比二元醇高,为了快速洗脱,必须增加改性剂的含量,但这也导致溶剂消耗增加。

 

4

结论

在本文中,使用 Sepmatix 8x SFC 进行柱筛选,并将开发结果转移到 Sepiatec SFC-50 进行放大。在色谱参数分辨率和运行时间方面,二醇基表现出最好的效果。对于二醇基,根据筛选结果,在 Sepiatec SFC-50 仪器上采用 250 × 10 mm 柱进行等度堆叠进样。作为比较,开发了另一种用于硅胶填料的方法,但分辨率值略差。

 

这种分离表明,要想在 prep-SFC 中获得一个好的分离方法,事先通过柱筛选确定最佳选择性是很重要的。然后,该方法可以在 prep-SFC 上简单实现,并进行了优化。最理想的是,该方法在等度条件下应用,以最大限度地提高产量。

 

每次注射后的叠加紫外信号表明该方法具有良好的再现性(图3和4,下面)。垂直线描述了收集相应分数的时间窗口。

 

3:堆叠进样与二醇柱分离。流速= 20 mL/min, 150 bar, 40℃,270 nm, 12% B,进样量= 0.12 mL;堆叠时间:2.42 min,注射次数:8次;上图:最终色谱图;下图为各注射剂的紫外信号叠加图

 

图4:堆叠进样与硅胶柱分离。流速= 16 mL/min, 100 bar, 40℃,270 nm, 34% B,进样量= 0.09 mL;堆叠时间:2.15 min,注射次数:7次;上图:最终色谱图;下图:分别在254 nm和270 nm处注射的叠加紫外信号

 

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参考文献

  1. https://doi.org/10.1093/chromsci/46.2.144

  2. DOI: 10.1021/jf030817m

  3. DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.11.013

  4. DOI: 10.1016/j.saa.2004.03.030

  5. Laboratory Chromatography Gμide, ISBN 3-033-00339-7, by Büchi Labortechnik AG (Switzerland)

 

 

 

 

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