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PCR实验的七大要素

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2024/2/22 13:31:15
  PCR是一种能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程。其扩增过程包括三个连续步骤:变性,对双链DNA模板进行加热,使其解离;退火,被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合;延伸,DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。多年以来,PCR的基本原理一直未变,但随着 DNA聚合酶和试剂性能的大幅提升,以及仪器和塑料反应管的不断创新,PCR实验方法也在不断改进。那么你知道PCR实验的七大要素吗?让我们一起来看看吧!
 
  一、DNA聚合酶
 
  DNA聚合酶是PCR的重要组成部分,它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有5′→ 3′聚合酶活性,即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸。
 
  早期的PCR,通常使用来源于 大肠杆菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 来生成新的子链。但是,这种 大肠杆菌酶对热敏感,易受到变性阶段高温度的破坏,从而无法继续进行退火和延伸步骤。因此,需要在全程每个循环的退火步骤中重新补充酶。
 
  二、热循环仪
 
  热循环仪是一种能够为PCR反应自动完成温度循环和孵育的仪器。在引入热循环仪之前,PCR反应是一个费时费力的过程,需在不同温度的水浴之间转移样品,并为每个步骤需要精确定时。
 
  三、模板DNA
 
  用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源,如基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)和质粒DNA。
 
  四、引物
 
  PCR引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合(通过序列互补)。在PCR反应期间,DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此,引物结合位点必须是靶标附近所有的,并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性,以确保目的片段的特异性扩增。
 
  五、脱氧核苷三磷酸(dNTP)
 
  dNTP由四个基本核苷酸组成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP——是新DNA链的组成元件。这四种核苷酸通常以相等摩尔量加入到PCR反应体系中,以实现最佳的碱基引入。但是,在某些情况下,如通过PCR方法进行随机突变,偶尔也会使用浓度不等的dNTP,以促进非校正DNA聚合酶产生更多的错误碱基插入。
 
  六、镁离子(Mg2+ )
 
  镁离子(Mg2+ )作为DNA聚合酶活性的辅助因子,有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外, Mg2+  能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷,从而促进引物与DNA模板形成复合物
 
  七、缓冲液
 
  PCR缓冲液能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5,一般使用Tris-HCl来调节。
 
  更多有关PCR实验的七大要素,请联系北京百奥创新科技有限公司。

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