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磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔单克隆抗体产品信息

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2024/3/11 16:16:51


反应性HMR Hm Mk Pg

灵敏度内源性

分子量(kDa)65

来源/同种型兔免疫球蛋白G

产品使用信息

应用稀释

蛋白质印迹法1:1000

Simple Western™1:10 - 1:50

免疫沉淀1:50

免疫荧光(免疫细胞化学)1:800 - 1:3200

流式细胞仪(固定/透化)1:800 - 1:3200

贮存 含有 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 叠氮化na。储存于 –20°C。不要等分抗体。

蛋白质印迹实验方案 对于蛋白质印迹,将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween ® 20 中一起在 4°C 下孵育过夜,并轻轻摇动。  注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂 从样品制备到检测,您的蛋白质印迹所需的试剂现在都在一个方便的套件中:#12957蛋白质印迹应用解决方案套件  注:用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。  

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS):( #9808 ) 要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH 2 O 中,混合。

10X Tris 缓冲盐水 (TBS):( #12498 ) 要制备 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。

1X SDS 样品缓冲液:蓝色上样包 ( #7722 ) 或红色上样包 ( #7723 ) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH 2 O稀释至 1X。

10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:( #4050 ) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。

10X Tris-甘氨酸转移缓冲液:( #12539 ) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH 2 O 中,混合。

10X Tris 缓冲盐水与 Tween ® 20 (TBST):( #9997 ) 要制备 1 L 1X TBST:将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。

脱脂奶粉:(#9999)。

封闭缓冲液:1X TBST,含 5% w/v 脱脂奶粉;对于 150 毫升,将 7.5 克脱脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBST 中并充分混合。

洗涤缓冲液:( #9997 ) 1X TBST。

牛血清白蛋白 (BSA):( #9998 )。

一抗稀释缓冲液:1X TBST,含 5% BSA;对于 20 ml,将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。

生物素化蛋白梯检测包:( #7727 )。

蓝色预染蛋白质标记物,宽范围 (11-250 kDa):( #59329 )。

印迹膜和纸:( #12369 ) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。

与 HRP 缀合的二抗:抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 )。

检测试剂:SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。


B. 蛋白质印迹 样品制备的通用方案。

通过添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞所需的时间。

从文化中吸取介质;用 1X PBS 清洗细胞;吸出。

添加 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl,10 cm 直径板每孔 500 µl)裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管中。保持在冰上。

超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。

将 20 µl 样品加热至 95–100°C 5 分钟;在冰上冷却。

微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。  

注:建议加载预染色分子量标记(#59329,10 µl/泳道)以验证

电转移和生物素化蛋白质梯(#7727,10 µl/泳道)以确定分子量。  

电转移至硝酸纤维素膜 ( #12369 )。


C. 膜封闭和抗体孵育

注:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm 2 ) 的膜;对于不同尺寸的膜,相应地调整体积。  

I. 膜封闭

(可选)转膜后,用 25 ml TBS 室温清洗硝酸纤维素膜 5 分钟。

将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次,每次 5 分钟。

二.一抗孵育

将膜和一抗(按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂)在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育,并在 4°C 下轻轻搅拌过夜。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次,每次 5 分钟。

将膜与抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 at 1:2000) 和抗生物素、HRP 连接抗体 ( #7075 at 1:1000–1:3000) 一起孵育,以检测 10 ml 溶液中的生物素化蛋白质标记物室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。

用 15 ml TBST 洗涤 3 次,每次 5 分钟。 继续检测(D 部分)。


D. 蛋白质检测

使用指南:

在 TBST 中洗涤膜结合的 HRP(抗体偶联物) 3 次,每次 5 分钟。

通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B(例如,对于 10 ml,添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B)来制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。搅拌均匀。

将基质与膜一起孵育 1 分钟,除去多余的溶液(膜保持湿润),用塑料包裹并暴露于 X 射线胶片。


* 避免反复接触皮肤。


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