本试剂供研究使用
实验目的：
本试剂盒用于测定人血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中白介素6(IL-6)的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人白介素6(IL-6)水平。用纯化的白介素6(IL-6)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入白介素6(IL-6)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的白介素6(IL-6)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中白介素6(IL-6)含量。
试剂盒组成：
试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片 | 2片 | |
密封袋 | 1个 | 1个 | |
酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
标准品 | 0.3ml×6管 | 0.3ml×6管 | 2-8℃保存 |
酶标试剂 | 5 ml×1瓶 | 10 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
样品稀释液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
终止液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
20×浓缩洗涤液 | 15ml×1瓶 | 25ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
普萘洛尔、酚妥拉明抑制人微血管内皮细胞体外血管生成目的研究离体情况下,p-AR阻断剂普萘洛尔、a-AR阻断剂酚妥拉明对人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表达的影响。
方法1.细胞免疫荧光鉴定内皮细胞：细胞采用免疫荧光染色Ⅷ因子进行鉴定。将人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞接种于24孔板爬片。待细胞融合至80%-90%时,4%冰固定20分钟,0.2%Triton X-100通透10分钟,羊血清封闭30分钟。兔多克隆Ⅷ因子（vWF）一抗4℃湿盒内过夜。TRITC标记的羊抗兔二抗室温孵育2小时（避光）。Hochest（1μg/ml）染核15分钟（避光）后10%甘油封片。正置荧光显微镜下观察、拍片（×200倍）。
2. Western blot检测人微血管内皮细胞a-AR的表达：未经药物处理的人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞经裂解获得总蛋白。BCA定量,沸水灭活。取总蛋白约40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后,转移到PVDF膜上。5%BSA封闭1小时,蛋白样品分别在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗过夜。次日在37℃孵箱中孵育相应的二抗1h。采用超敏ECL化学发光试剂盒显色,于暗室内压片,显影定影。
3.细胞增殖实验：将人皮肤微血管内皮细胞种植于96孔板,将不同浓度梯度的普萘洛尔（0,25,50,75,100μM）、酚妥拉明（0,10,30,50,70μg/ml）分别处理细胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8,孵箱中继续培养2h。之后于酶标仪测450nm下吸光度值。
怎么挑选适合自己实验的抗体
一、关于特异性的挑选：
特异性的挑选首要需求考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、试验方法特异性、符号物的特异性。
1、蛋白特异性：
针对需求检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意检查抗体说明书的检测说明。假如重组蛋白不是全长表达，则需求注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。
内源性蛋白能清楚其剪切与润饰的方式，特殊表型的蛋白需求进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，检查穿插反应的状况。化蛋白检测需求确认具体位点，不同位点的化意味着或许有不同的机制存在，不宜混为一谈。
2、种属特异性：
同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或规划多肽抗原的，根据蛋白的同源性状况与其他种属发生穿插反应。需求参照说明书注明的可反应种属信息。
一些稀有种属很难找到抗体，可以经过蛋白的序列比对，挑选同源序列免疫的抗体，不过一般这种状况生产商不会受理其关于质量的申述，假如可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体挑选。。
3、符号物的特异性
一般基于试验操作的试验方法不会运用带有符号的一抗，比方WB、IHC等，都是经过二抗类的试剂符号达到成果出现的意图。可是基于仪器剖析的一些试验，或许就会运用到直接符号的一抗，比方流式试验。那么需求了解到自己将要运用的仪器能检测到的荧光规模，针对不通的参数要求挑选对应的符号物。在免疫荧光双标试验中，需求选配不同的荧光符号物。
二、抗体种属来历的挑选：
有人以为单抗比多抗好，其实这并不是一个严谨的观点，只能说在或许性上单抗的特异性一些，而多抗的亲和力会优于单抗，而且特异性并不一定就逊于单抗，首要看抗原的规划水平。
商品化抗体里单抗首要是鼠单抗、兔单抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他种属来历抗体较少。不主张纠结于单抗好还是多抗好，能做出试验的抗体便是好抗体。
在挑选上一般主张试验种属和抗体种属亲缘性越远越好，不宜同源。抗体不同种属会要影响接下来二抗的选配。特别是在免疫荧光双标试验中，需求在差异于试验种属的基础上，区分开两个目标的抗体种属来历，以便于二抗差异识别。
三、关于品牌的挑选：
由于抗体品质的异质化，关于抗体的品牌挑选就被我们所注重，可是不管是什么品牌都难免会遇到不合适自己试验的抗体。所以一般主张考虑那些业界普遍认可、购买方便、专业、售后处理快捷的品牌。
一些乃至都没有正式代理的，只能备选。一起购买时一定要找可以供给产品指导、试验剖析、售后处理的正规代理商购买，防止由于买到假货水货影响试验。
其实或许只是生产商只检测时运用了不同的种属不同的样品类型，或是参照了不同的文献，对运用者来说，相同的样品，不管运用哪个品牌的，只需抗体是对的，意图条带只会出现在相同的位置。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项：
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。样本在使用前也要在室温平衡60分钟。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
ELISA试剂盒运用应当留心哪些事项
1、ELISA试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可运用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2、浓洗刷液可能会有结晶分出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗刷时不影响效果。
3、各步加样均应运用加样器，并常常校正其准确性，以避免实验过失。一次加样时刻好控制在5分钟内，如标本数量多，举荐运用排枪加样。
4、请每次测定的一同做规范曲线，好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于规范品孔孔OD值的)，请先用样品稀释液稀释必定倍数(n倍)后再测定，核算时请终乘以总稀释倍数(×n×5)。
5、严格按说明书的操作进行，ELISA试剂盒效果判定有必要以酶标仪读数为准.
6、本试剂不同批号组分不得混用。
7、封板膜只限一次性运用，以避免穿插污染。
8、悉数样品，洗刷液和各种废弃物都应按感染物处理。
9、底物请避光保存。
技术提示：
1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是实验结果准确性的必要条件。
4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
8、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
试剂盒性能：
1. 样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2. 批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15% 。
抗体的保质期与储存温度相关吗
作为各类种属的高质量血清供应商，一般客户咨询血清购买时，我们都会推荐牛血清。而我公司zui为热销的血清产品中莫过于胎牛血清了，那么为何牛血清在细胞培养实验中如此受宠呢？据酶联生物技术员分析，主要原因有这五个方面：
1. 提供结合蛋白：作用是携带重要地低分子量物质，在细胞代谢过程中起重要作用。
2. 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
3. 提供基本营养物质：氨基酸、维生等是细胞生长必须的物质。
4. 提供激素和各种生长因子。
5. 对培养中的细胞起到某些保护作用。
针对第五个原因，我们来重点谈谈。有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。
我司技术员分析，这是因为胰蛋白酶已经被用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了的粘度可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用。
特别说明到了有多位老师提出问题：人血清一定要加热灭活吗？不然会怎样？其实对于它的加热灭活是应该根据情况而定的。
很多朋友在使用实验者认为一定需要加热灭活，其实这个认知是不正确的，是否需要灭活是要根据情况而定。人们通常通过在56℃加热30分钟的办法，来灭活其中的补体，以及其中可能的微生物（比如支原体）的污染。
加热灭活带来的问题是，其中的氨基酸、维生素和生长因子等也会不同程度的被破坏。
但是它的补体含量很低，即使在未稀释的胎牛血清中，也观察不到溶血现象。另外37℃的加热能够灭活补体。所以对它而言，并不需要通过专门的热灭活来灭活其中的补体。
早期的人血清制备中的滤膜的孔径大于0.22um，不能的去除支原体的污染。热灭活可以去除支原体的污染。但是现在制备中的终端滤膜的孔径为0.1um甚至小到0.04um，所以一般没有支原体的污染。
通过以上，我们公司总结：除非有特别的情况，标准厂家生产的一般不需要加热灭活。不过因考虑到其质量问题，为安全起见，还是以加热灭活为好。
