（一）抗原抗体反应
根据RIA原理，将未标记抗原（标准品和待测样品）、标记抗原和特异性
抗体加入反应试管中，在一定条件（温度、时间及介质pH）下进行竞争抑制反应；为取得*实验效果（如灵敏度及检测浓度范围），上述三种主要试剂可同时反应（平衡法），也可采用非平衡法，先加待测样品（或标准品）和抗血清，使非标记抗原与抗体达到结合平衡，然后再加入标记抗原竞争与抗体结合。此外，反应温度和时间可依据具体待检抗原的特性和所用抗体亲和力（K值）大小等条件进行选择。若抗原性质稳定且含量高，反应时间可较短（数小时），反应温度可选室温或37℃；若抗原的理化性质不稳定（如某些小分子肽）或含量甚微、或抗体的K值较低，则应选低温（4℃）长时间（20～24h）反应条件。
剂量-反应（竞争—抑制）曲线图
（二）分离结合与游离标记物
RIA反应平衡后，标记抗原与试剂抗体形成免疫复合物（B）。由于其含量极少，不能自行沉淀，因此需加入适当的沉淀剂才能将其*沉淀，然后经离心使其与游离的标记抗原（F）分离。某些小分子抗原，也可采用吸附法分离B与F。
B、F分离步骤所造成的误差是RIA实验误差的重要组成部分，可影响方法的灵敏度和测定的准确性。理想的分离方法应分离*，迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡，而且效果不受反应介质因素的影响；操作应简单、重复性好以及经济。
