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 1.免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯　制备价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此，用于免疫的抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质，血清的效价与特异性是矛盾的，通常以价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不*佐剂zui常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能获得价的免疫血清。用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除γ球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，主要是IgG类，其提纯方法很多，但以饱和硫酸铵盐析法比较简便，也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤），以及离子交换层析法等，或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。

2.荧光色素的标记　能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。适于标记蛋白的荧光色素主要有异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC），四乙基罗达明（rho-damine B200，RB200）和四甲基异硫氰基罗达明（tetramethyl rhodamine isotheynate，TMRITC）。实际上目前应用zui多的只有异硫氰酸荧光黄一种。

（1） FITC标记　FITC为黄色结晶形粉末，分子量为389，易溶于水和酒精等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，zui大吸收光谱为490-495nm，FITC的溶液不稳定，易因水解或迭聚而变质，故需在配好后2h内应用。

FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）结合，形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基，但一般zui多只能标记15-20个。

① 直接标记法　取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水17ml，混合，在4℃电磁搅拌下加FITC3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4℃继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，以除去未结合的游离荧光素。

② 透析标记法　将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L，pH9.0调动1% （W/V ），并装入透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4℃搅拌16-18h取出透析袋于0.01mol/L，pH7.2PBS中透析4h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，去除游离荧光素。

（2） RB200标记　本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分子量为580，zui大吸收光谱为570nm，呈明亮的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。方法为：取1g RB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳钵中研磨5min（在毒气操作橱中），加 10ml无水丙酮，放置5min，随时搅拌，过滤，用所得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液（0.5mol/L，pH9.5）稀释，逐滴加入0.1ml RB200溶液，随加随搅拌，在0-4℃继续搅拌 12-18h。

（3） TMRITC标记　TMRITC为紫红色粉末，性能比较稳定，分子量为443，zui大吸收光谱为550nm，呈橙红色荧光。其结合方法与FITC的直接标记法相同，只是所加色素量为蛋白质量的1/30-1/40，结合时间持续16-18h。

（4） 影响标记的主要因素　温度、时间、酸碱度和标记量4个因素。温度低，标记时间长，温度高，标记时间应短。FITC0-4℃以6-12h为宜，20-25℃以1-2h为宜，37℃30-45min为宜。pH低时，标记较慢，pH值偏高（大于10），抗体易变性，pH值9.0-9.5zui为适宜。抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含20-25mg蛋白为宜。至于标记方法，各有特点，但均不能去除非特异荧光染色因素。透析法适用于小体积的标记。

3.标记抗体的纯化　抗体标记以后，应立即进行纯化处理，以消除或降低非特异性染色和特异交叉染色。其步骤如下：

标记抗体溶液

↓透析或凝胶过滤

去除游离荧光色素

（粗制荧光抗体）

↓DEAE-纤维素层析

去除过度标记的蛋白分子

（精制荧光抗体）

↓抗原交叉吸收或组织制剂吸收

去除特异交叉反应的标记杭体

（免疫纯荧光抗体）

根据免疫荧光试剂的具体用途，纯化的方法可以不同，并不是每一种荧光试剂都须经过以上全部过程。对于某些细菌诊断试剂，只要除去游离荧光素就可以，检测病毒抗原的荧光抗体一般要求下述处理：

（1） 游离荧光素的去除　去除标记过程中未与蛋白质结合的游离荧光素，是纯化标记试剂的zui基本要求，不经过这一步处理，任何免疫荧光试剂都不能应用。

① 半透膜透析法　利用荧光色素分子可以通过半透膜，而蛋白分子则因分子量大不能通过的原理，逐步将游离色素除去。先将标记好的抗体溶液装于透析袋或玻璃纸袋内，注意使液面上留有一定空间，扎紧袋口，先用流动自来水透析5 min，再转入PBS （ 0.01mol/L，pH7.2）或生理盐水中继续透析，外液量至少大于内液量100倍，透析应在低温（0-4℃）下进行，每天换液3-4次，整个透析时间约需1周左右，时间过长容易造成蛋白质变性，影响荧光抗体的质量。取透析液（外液）以紫外线灯检查，若无荧光出现，即可停止透析。

② 凝胶过滤法　利用荧光色素分子和蛋白质分子量的悬殊差别，通过分子筛除去游离荧光素，一般1h以内即能完成操作，但与透析法结合进行。先将标记抗体溶液透析4 h，除去大部分游离荧光素和其他小分子物质以后，再进行凝胶过滤，这样有利于保护凝胶柱，延长使用时间。凝胶柱sephadex G25和G50装好后，以洗脱液（0.001mol/L或0.005mol/L PBS，pH7.0-7.2）平衡，然后加入样品，样品与柱床容积的比例1:2以下皆可。样品全部进入柱床后，即可进行洗脱。应用此法可使游离荧光素*除去，同时荧光抗体可以100%回收。

（2） 过度标记的蛋白分子的去除　去除游离荧光素后，结合物中存在的未标记的和过度标记的蛋白质，是降低染色效价和出现非特异性染色的主要因素。常用的方法是DEAE-纤维素或DEAD-葡聚糖凝胶层析，结合物通过层析柱后，过度标记的部分（易出现非特异性）被吸附，过低标记的或未标记的部分（易降低敏感性）自由流出，从而可以得到荧光素与蛋白质结合比zui适的部分。

DEAD-纤维柱用PBS平衡后，柱上端放一大小合适的滤纸片，打开下口，调解流速至每分钟10-20滴左右，待柱上液面剩一薄层PBS时，用吸管滴加标记样品，样品进入柱床尚离一薄层时，用适量PBS冲洗管壁，然后用大量0.01mol/L，pH7.2PBS洗脱，用20%磺基水杨酸液试测洗脱液。待蛋白出现阳性反应时即可收集，蛋白反应阴转时停止收集，该洗脱液即为纯化的标记抗体。

（3） 特异交叉或额外应用性标记抗体的去除　去除特异交叉或额外应用标记抗体，常用组织粉末吸收法，zui常用的是肝粉，这一步处理对标记的抗体来说，损失是很大的，一般可省去这一步。

4.标记抗体的鉴定　经过以上各种程序所获得的精制荧光抗体，使用前须做特异性测定、敏感性鉴定以及纯度测定后，才可正式用于荧光抗体染色。

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