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DNA实验技术:亚硫酸氢盐修饰后测序法检测甲基化

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2013/7/27 14:00:59


 

甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)

甲基化是目前的研究热点,就我所做的一点工作并其中一点心得,与大家分享。希望能够对大家有所帮助。
 
*部分 基因组DNA的提取。
这一步没有悬念,*可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取*可以。DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节:
1:蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;
2:RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二:
1:紫外分光光度计计算OD比值;
2:1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法,这种方法*可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。
 
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水(DDW)均经高压蒸汽灭菌。
1:将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul;
2:加5.5ul新鲜配制的3M NaOH;
3: 42℃水浴30min;
水浴期间配制:
4:10mM对苯二酚(氢醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)
5: 3.6M亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,zui终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6:EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液。
7:加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化。
8:50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适。
这一步细节:
1:基因组DNA的量不需十分,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰zui多可至4ug。
2:所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要。
3:亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
4:水浴达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不*。

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