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Cell Counting Kit-8

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2016/3/22 15:56:43

Cell Counting Kit-8

产品简介:     Cell Counting Kit-8 简称CCK-8试剂盒,为MTT法的替代方法,是一种基于WST(水溶性四唑盐,化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。可用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏等试验

使用说明:

一、制作标准曲线(测定细胞具体数量时

1先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。 

2按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。

3接种后培养细胞贴壁,然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD 值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X 轴),OD 值为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。)

二、细胞活性检测

1在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(在37,5% CO2的条件下)。 

2向每孔加入10μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。 

3将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 

4用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 

5如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增值-毒性检测

1在96孔板中配置100 μL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37 ,5% CO2的条件下)。 

2向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。

3、向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。

4将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

5用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

6如果暂时不测定OD 值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

活力计算:.

细胞活力%)=[A(加药)A(空白)][ A(0加药)A(空白)]×100 

A(加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度 

A(空白):具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度 

A(0 加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 

细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项: 

建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。 

白细胞可能需要培养较长时间。 

当使用标准96 孔板时,贴壁细胞的小接种量少为1 ,000个/孔 (100 μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 ( 100 μL培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10% 加入CCK-8溶液。 

如果没有450nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm 之间的滤光片,但是450nm检测灵敏度高。 

培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

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