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IPTG诱导蛋白表达步骤说明

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2016/4/27 10:15:52

异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用*的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

材料

1、诱导表达材料

( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g

NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%

蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

适用范围:大肠杆菌

( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存。

( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液:

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS (电泳级)

0.1 % 溴酚蓝

10 % 甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

1 )酶溶法

(1)裂解缓冲液:

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

(2)50 mmol / L (PMSF )。

(3)10 mg / mL 溶菌酶。

(4)脱氧胆酸。

(5)1 mg / mL DNase I。2 )超声破碎法

( 1 ) TE 缓冲液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液:

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 % 溴酚蓝

20 % 甘油

实验方案

1、外源基因的诱导表达

( 1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。

( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定确定无误后进行下一步。

( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。

( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测。

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化

1 )细菌的裂解

常用方法有:① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。

主要步骤为:

① 4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL )。弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀。

注意事项:培养噬菌体时,Top agar中的添加量为:25 μl/3 ml(24 mg/ml)。含有IPTG的培养基4℃避光保存,须在1~2 周内使用。

保存:IPTG要2-8°C冷藏保存,配制好后保存于-20°C,室温可放置一个月。远离热源及氧化剂

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