用于通过 SDS-PAGE 分离磷酸化蛋白质

Phos-tag^® Acrylamide

仅需将Phos-tag^® Acrylamide与丙烯酰胺溶液混合并聚合，即可生成用于分离磷酸化和非磷酸化蛋白质的Phos-tag^® SDS-PAGE。

在不使用放射性同位素的情况下，利用 Phos-tag™ SDS-PAGE 即可分离不同条带中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分离后的凝胶可用于 Western blotting 和质谱分析等后续实验。

Phos-tag™ SDS-PAGE 操作简单，只需在常规 SDS-PAGE 胶中加入 Phos-tag™ Acrylamide 和 Mn²⁺ 或者 Zn²⁺ 即可进行实验。在电泳过程中，磷酸化蛋白的磷酸基团与 Phos-tag™ 中的二价金属离子相结合，降低其迁移速度，从而可区分磷酸化与非磷酸化蛋白。

◆优点、特色

● 采用 Phos-tag™ SDS-PAGE 可轻松分离磷酸化蛋白

无任何放射性元素及化学标记！

● 不论氨基酸残基的类型/位点如何，均可使用

可用于未知的磷酸化分析

可用于检测新的磷酸化位点（无需购买商品化磷酸化抗体、无需特意制备磷酸化抗体）

● 磷酸化位点数量/位点不同的磷酸形式也可分离

显示磷酸化程度和磷酸化形式

● 可同时检测磷酸化/非磷酸化形式

可定量各种磷酸化形式

可简单明确有无磷酸化

● 无需RI或特殊的仪器

实验成本低，操作简单。（SDS-PAGE的试剂→只要有设备即可使用）

● 电泳后可用于WB、MS分析，也可用于二维电泳

WB：可分析内源性蛋白

MS：可显示各磷酸化形式的磷酸化位点的组合

二维电泳：可分离相同等电点和分子量的磷酸化形式

适用于内源性蛋白的磷酸化分析！

◆Phos-tag^® SDS-PAGE的原理

Phos-tag^® Acrylamide的结构

1. 电泳中的磷酸化蛋白会被2个二价金属离子捕获

2. 磷酸化水平越高，电泳速度越慢

3. 根据磷酸化水平进行分离（即使磷酸化位点的数量相同，只要位置不同也可进行分离）

常规的SDS-PAGE（上图：非Phos-tag^® 条件下）中，无法确认底物是否被磷酸化。

◆案例、应用

【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比较】

“我推荐使用Phos-tag ™ ——东京大学研究院医学研究科 小川觉之”

　　Phos-tag ™ 是专为研究磷酸化蛋白而新开发出来的试剂。此产品使用方便，不但可用于体外实验，还能定量分析体内蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常规电泳实验，无需购买特殊设备，性价比高。传统蛋白磷酸化的研究需要特异的磷酸化抗体、RI 等其它试剂，操作复杂，花费大，且放射性元素会有安全隐患，而 Phos-tag ™ 的出现恰恰可以弥补这些缺点，为磷酸化蛋白研究提供新的方向。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分离效果图

　　Lane 1 为非磷酸化蛋白，Lane 2-5 为磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化状态不同而条带迁移率也有所不同。

　　磷酸化/ 非磷酸化蛋白的数量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的丰度等都可根据条带迁移和条带浓度求得。

【资料提供】

日本东京大学研究生院医学系研究科

【二维电泳中的应用：分析 hnRNP K 磷酸化异构体】

　　小鼠巨噬细胞 J774.1 经 LPS 刺激后，裂解细胞，经过免疫沉淀法分离得到 hnRNP K 。在二维电泳中，一维是IPG 胶，二维是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分离 hnRNP K 的异构体。利用质谱仪，可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

二维电泳

　　同一个等电点的位置上，不同位点发生磷酸化都可以被区分开来（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【参考文献】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

　　横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）理化学研究所 RCAI 小原收

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的变化】

　　常规 SDS-PAGE 和Phos-tag^TM SDS-PAGE 后迚行克疫印迹实验分析 EGF 刺激的 A431 细胞中 MAPK 磷酸化水平。

摘自 Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.

【使用示例：α-酪蛋白去磷酸化反应随时间的变化】

使用Phos-tag^® SDS-PAGE和常规SDS-PAGE分离碱性磷酸酶随时间（孵育时间：0~120 min）去磷酸化的α-酪蛋白样品。

◆相关产品

phos-tag™ 由日本广岛大学研究生院医齿药学综合研究科医药分子功能科学研究室开发，对应指导手册请通过以下链接获取：

http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/pdf/show/19.html

操作视频，请点击：

样品处理（TCA沉淀）：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/resources/show/47.html

凝胶制备：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/resources/show/48.html

已公开的验证蛋白列表，请查看链接：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/gories/show/123.html