提供商:   上海研谨生物

服务名称:        western blot服务

规格:              实验服务

实验步骤:

一、试剂准备

1. SDS-PAGE试剂: 见聚丙烯酰.胺凝胶电泳实验。

2.匀浆缓冲液: 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml; 10%SDS 6.0 ml; β-巯基Z醇

0.2 ml; ddH2O 2.8 ml.

3.转膜缓冲液:甘氨酸29g; Tris5.8g; SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH20定容至

1000 ml.

4.0.01 M PBS(pH7.4): NaCl8.0g; KC10.2 g; Na2HPO4 1. 44 g; KH2PO4 0.24 g;

加ddH20至1000ml。

5.膜染色液:考马斯亮兰0.2g;甲醇80 ml;乙酸2 ml; ddH2O118 ml。 包被液(5%脱

脂奶粉，现配) :脱脂奶粉1.0 g溶于20 m的0.01 M PBS中。

6.显色液: DAB 6.0 mg; 0.01 M PBS 10.0ml; 硫酸镍胺0.1 ml; H202 1.0 μl。

二、蛋白样品制备

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取

(1)倒掉培养液， 并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一

钆使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。

(2)每瓶细胞加3 ml 4°C预冷的PBS (0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1 min洗涤

细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净

后把培养瓶置于冰上。

(3)按1m 裂解液加10 μl PMSF (100 mM)，摇匀置于冰上。(PMSF 要摇匀至无结晶

时才可与裂解液混合。)

(4)每瓶细胞加400μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养

瓶要经常来回摇动。

(5)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)， 然后用枪将细

胞碎片和裂解液移至1.5 mI离心管中。(整个操作尽量在冰 上进行。)

(6)于4°C下12000 rpm离心5 min。(提前开离心机预冷)

(7)将离心后的.上清分装转移倒0.5 m的离心管中放于- 20°C保存。

2.组织中总蛋白的提取

(1)将少量组织块置于1 ~ 2 m匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪

碎。

(2)加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

(3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上， 要重复碾几次使组织尽量碾碎。

(4)裂解30 min后,即可用移液器将裂解液移至1.5 mI离心管中,然后在49C下12000

rpm离心5 min,取上清分装于0.5 mI离心管中并置于- 20°C保存。

3.加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细

胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:

(1)将培养液倒至15 m|离心管中，于2500 rpm离心5 min.

(2)弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。弃上清

后用PBS重复洗涤--次。

(3)用枪洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF) 冰上裂解30 min,裂解过程中要经

常弹一弹以使细胞充分裂解。

(4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起49C、 12000 rpm离心5 min,取上清分装于

0.5 mI离心管中并置于- 20C保存。

三、蛋白含量的测定

1.制作标准曲线

(1) 从- 20°C取出1 mg/ml BSA, 室温融化后,备用。

(2)取18个1.5 mI离心管, 3个一组，分别标记为0 mg, 2.5mg, 5.0mg，10.0 mg,

20.0mg， 40.0mg。

(3)按下表在各管中加入各种试剂。

(4)混沟后，室温放置2 min。在生物分光光度计(Bio-Photometer, Eppendorf).

上比色分析。

2.检测样品蛋白含量

(1)取足量的1.5ml离心管，每管加入4°C储存的考马斯亮蓝溶液1ml。 室温放置

30 min后即可用于测蛋白。

(2)取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCI容液100 ml,混匀放置2分钟可做为空白样

品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

(3)空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用无菌水洗- -次。

(4)取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCI NaCI溶液和5mI待测蛋白样品，

混匀后静置2 min, 倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意:每测一个样品都要将比色杯用无水Z醇洗2次，无菌水洗一次。 可同时混合好

多个样品再一起测，

这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5mI样品含的蛋白量。

四、SDS- PAGE电泳

1.清洗玻璃板

一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，

再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

2.灌胶与上样

(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两

玻璃对齐以免漏胶。)

(2)按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10m

枪吸取5m胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层

水，液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速

度。操作时胶-定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，

否则胶会被冲变型。)

(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可

倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

(4)按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓

缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产

生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的

上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固

后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

(5)用水冲洗-下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内，大玻璃板面向

外。若只跑一块胶，那槽另- -边要垫一块塑料板且有字的- -面面向外。)

(6)测完蛋白含量后，计算含50ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至

0.5m离心管中，加入5xSDS.上样缓冲液至终浓度为1x。(上样总体积-般不超过15

μl,加样孔的大限度可加20μ样品。)上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白

变性。

(7)加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。 )用微

量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓

慢加入样品。(加样太快可使样 品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入

下-个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

3.电泳

电泳时间一般4 ~5h,电压为40 V较好，也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止

电泳，进行转膜。

五、转膜

1.转一张膜需准备6张7.0~ 8.3 cm的滤纸和1张7.3 ~ 8.6 cm的硝酸纤维素膜。切

滤纸和膜时-定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于

水上浸2 h才可使用。(用镊子捏住膜的-边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮

于水上，只有下才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸

湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一-层空 气膜，这样会阻止膜吸水。

2.在加有转移液的搪瓷盘 里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、-支玻棒、滤纸和浸

过的膜。

3.将夹子打开使黑的一 面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以

擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层

滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气

泡。

4.要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬-会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。(撬时一 定要小心，玻板很易裂。)除

去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作)，要避免把分离胶刮破。 小

心剥下分离胶盖于滤纸上，手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖

于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去

气泡。后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，

要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。(转移液含

甲醇， 操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。)

5.将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转

移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h. .

6.转完后将膜用1x丽春红染液染5 min (于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上

的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。

六免疫反应

1.将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动

封闭1h。

2. 将抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5 m离心管中) ;撕下适当大小的-块儿保鲜膜

铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从

封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜

四角以赶出残留气泡;室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次

10 min;再用TBS洗-次，10 min.

3.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1 ~2 h后，用TBST在室温下脱

色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗- -次， 10 min,进行化学发光反应。

七、化学发光,影，定影

1.将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合; 1 min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充

分接触; 1 min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液，包好,放入X-光片夹中。

2. 在暗室中,将1x显影液和定影液分别到入塑料盘中;在红灯下取出X -光片，用切

纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1 cm) ;打开X-光片夹，把X -光片放在膜

上，-旦放上,便不能移动，关上X光.陕，开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光

时间，-般为1 min或5 min,也可选择不同时间多次压片，以达+*佳效果;曝光完

成后，打开X-光片夹， 取出X-光片, 迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带

后，即刻终止显影。显影时间-般为1~2 min (20~ 25°C)，温度过低时(低于

16°C) 需适当延长显影时间;显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时

间-般为5 ~ 10 min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾

干。

应注意的是:显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片,否

则会对结果产生影响。

八凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

展开

注意事项:

1.一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定+*佳条

件。

2.显色液必须新鲜配置使用，后加入H2O2。

3. DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

其他:

一、免疫反应

1.用0.01 M PBS洗膜，5 min x3次。

2.加入包被液，平稳摇动，室温2 h。

3.弃包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 minx3次。

4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部)，49C 放

置12 h以上。阴性对照，以1%BSA取代-抗，其余步骤与实验组相同。

5.弃-抗和1%BSA,用0.01 M PBS分别洗膜，5 minx4次。

6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释)，平稳摇

动，室温2 h。

7.弃二抗，用0.01 M PBS洗膜，5 minx4次。

8.加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

实验代做服务：