中检维康iELisaT-2毒素检测试剂盒

1. 概要

T2毒素（T2）是由多种镰刀菌产生的一种霉菌毒素。主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品，对人类健康及畜牧业构成了较大危害。T-2毒素主要影响血液，肝脏，肾脏，胰腺肌肉及淋巴细胞的功能，T-2毒素中毒后的一般临床症状为厌食、呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍等。使用T2毒素试剂盒则能够快速而准确的分析样品中T2毒素残留。

1. 原理

测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有偶联抗原。分别加入T2毒素标准品或样品、酶标记物和抗体于微孔中，样品/标准品竞争结合抗体，酶标记物可与一抗结合，再于酶标版上的包被抗原结合。反应洗涤后，加入TMB底物显蓝色，加入终止液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在450nm处检测，吸光值与样品中T2毒素含量成负相关，与标准曲线比较即可得出T2毒素的含量。

1. 试剂盒的组成

1. 包被有抗原的96微孔板：1块（96 孔，12条×8 孔）
2. T2毒素标准品：0ng/mL、0.5ng/mL、 1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL                        1 瓶 × 1.0mL
3. T2抗体                      1瓶 ×10mL
4. 酶标记物                    1 瓶 ×10mL
5. 10× 浓缩洗涤液：            1瓶 × 50mL
6. T2稀释缓冲液A：             1瓶 × 50mL
7. T2稀释缓冲液B：             1瓶 × 50mL
8. 显色底物TMB：              1瓶 × 17mL
9. 终止液：                     1瓶 × 7mL
10. 试剂盒说明书：               1份
11. 质检报告：                   1份

1. 需要的仪器、试剂

1）仪器   

1. 酶标仪450nm（iELisa全自动酶标仪或相当者）
2. 微量移液器：20μL-200μL单道，100μL-1000μL单道, 50μL-300μL八道
3. 多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器）
4. 酶标板振荡器
5. 涡旋混合器
6. 50mL离心管
7. 1.5mL离心管
8. 定性滤纸
9. 过滤漏斗
10. —天平：感量0.01g

1. 试剂

1. 样品提取液70%甲醇：取700mL甲醇，加300mL纯水，混匀。

1. 样品处理

5.1谷物（玉米、小麦、高粱、大米、大豆）：

1. 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液70%甲醇,置于多功能旋转混合器上振荡30分钟（或使用高速均质器均质3分钟，或摇床上振荡40分钟）。
2. 将提取液用普通滤纸过滤，吸取100μL滤液置于1.5mL离心管中，加入900μL T2稀释缓冲液A，用涡旋混合器混匀。

稀释倍数：50

5.2饲料：

1. 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液70%甲醇,置于多功能旋转混合器上振荡30分钟（或使用高速均质器均质3分钟，或摇床上振荡40分钟）。
2. 将提取液用普通滤纸过滤，用0.22μm有机系滤膜过滤后，取100μL滤液置于1.5mL离心管中，加入900uL T2稀释缓冲液B，用涡旋混合器混匀。

稀释倍数：50

6． 酶联免疫分析程序

6.1测定之前注意事项

1. 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。
2. 使用后迅速将试剂放入2-8℃冷藏。
3. 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4. 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖板覆盖住酶标板。

6.2溶液的配制

1. 提取液的配制: 根据实验所需的量配制70%的甲醇水溶液（水要用纯水、或蒸馏水、去离子水）
2. 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释10倍后使用。（例如：取10 mL 浓缩液+90 mL纯水, 可以用于32孔的检测）。

6.3测定程序

1. 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2. 分别吸取50μL标准品和样品加至相应的微孔（双孔）中，然后再各加入50μL的酶标记物，后加入50μL的T2抗体，装入袋中密封，室温（25℃）温育20分钟。
3. 倒出孔中的液体，每孔加入250μL稀释好的洗涤液洗涤，重复操作四次。洗板时每次间隔30s，洗完后用力在吸水纸上排干。
4. 每孔加入100μL显色底物，避光室温（25℃）温育10分钟。
5. 每孔加入50μL终止液，混匀。
6. 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸光度值（OD值），参比波长630nm。（iELisa全自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。

7.  结果判定

1）所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以DI个标准（0标准）的吸光度值（B<苏b>0）再乘以100%，即百分吸光度值。

以T2毒素标准品浓度值（ppb）为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

1. 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍数。
2. 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一定的比例用70%甲醇进行稀释。

8.  注意事项

1. 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。
2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
3. 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在光线下。
4. 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。
5. 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。
6. 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不准确。
7. 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。

9.  中检维康iELisaT-2毒素检测试剂盒的性能指标

1. 检测限LOD: 谷物10ppb(μg/kg)，饲料15ppb，（LOD：空白样品测定值+2倍标准偏差SD）
2. 定量限LOQ: 谷物25ppb，饲料30ppb。
3. 定量检测范围：谷物25-1000ppb，饲料30-1000ppb。