黄曲霉毒素(Total Aflatoxins)M1免疫亲和柱操作说明书

【概要】

黄曲霉毒素（Aflatoxin）是黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，被世界卫生组织的癌症研究机构划分为1类致癌物，同时又是一种毒性*的剧毒物质，广泛存在于各种食物中。玉米，花生，大米，小麦等谷物及其副产品是黄曲霉毒素的主要来源，同时饲料中的黄曲霉毒素B1经过动物代谢后产生的黄曲霉毒素M1仍然具有很强的毒性和致癌性，也广泛存在牛奶，血液，组织等食品中。黄曲霉毒素作为肝癌的三大诱因之一，也是胃癌，肠癌等疾病的主要原因，对人类的健康构成很大威胁。世界各国对食品，饲料中的黄曲霉毒素都有严格的*。2010年6月1日开始施行的乳品安全国家标准中对乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的检测进行了规定，主要使用的样品前处理方法就是免疫亲和柱净化法。

【适用范围及性能】

   本公司真菌毒素免疫柱系列产品测试形式是一个高性能的免疫亲和柱，设计用于在进行 HPLC（高效液相色谱法）、GC-MS（气相色谱-质谱联 用 仪）、ELISA（酶联免疫吸附剂测定）之前清理（净化）或 浓缩样本。

   用于定性、定量检测牛奶，奶粉，发酵乳，干酪，奶油等样品中黄曲霉毒素M1的以及样品前处理。

柱容量：≥100ng

回收率：≥90%

【试验原理】

本产品的测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素M1单克隆抗体连接在柱内凝胶上，样品中的黄曲霉毒素M1经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢的通过黄曲霉毒素M1免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内，毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质。用甲醇洗脱黄曲霉毒素M1，然后注入到分析仪器中用于检测。

【包装组成】

黄曲霉毒素M1标准品（选配）

25支/盒，3mL柱管/支

产品说明书1份

【需要而未提供的设备及试剂】

设备：

┅┅高速均质器或组织匀浆机

┅┅粉碎机

┅┅200mL/50mL量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅酸度计

┅┅分液漏斗

┅┅微量移液器：单道 100mL～1000mL

┅┅槽纹滤纸（折叠快速定性或定量滤纸）

┅┅50mL漏斗

┅┅旋转蒸发仪

┅┅一次性玻璃试管

┅┅泵流操作架（包括空气泵，不同容积的玻璃注射器等）

┅┅烧杯，容量瓶，锥形瓶等

试剂：

┅┅甲醇（色谱级）

┅┅乙腈（色谱级）

┅┅石油醚

┅┅蒸馏水或去离子水

┅┅氢氧化钠溶液（0.5mol/L）称取2g氢氧化钠溶解于100mL水中

【样本处理步骤】

（一）牛奶

┅┅将100mL牛奶水浴加热至40 oC；

┅┅4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用

（二）乳粉和粉状婴幼儿配方食品

┅┅称取10g奶粉样品，将100mL50 oC水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解

┅┅6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用

（三）发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)

┅┅称取60 g混匀的试样，用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4；

┅┅用高速均质器在 9500 转/分钟下告诉匀浆5 min

┅┅水浴加热至40 oC；

┅┅4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用

（四）干酪

┅┅称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；

┅┅用高速均质器在 9500r/分钟下告诉匀浆5 min；

┅┅超声提取30 min；

┅┅在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

┅┅在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3），振摇2 min；

┅┅待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。

┅┅重复用石油醚提取2次；。

┅┅将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL；┅┅浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中；

┅┅加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。

（五）奶油

┅┅称取5g试样，置于50 mL烧杯中；

┅┅用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。

┅┅加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中；

┅┅待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。

【亲和柱净化步骤】

┅┅将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL清澈液注入玻璃注射器；

┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；

┅┅更换10ml玻璃注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。

┅┅准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

【结果判定】

经免疫亲和柱净化后，收集到的乙腈洗脱液可直接使用荧光计或者HPLC检测，也可使用薄层色谱或者酶联免疫试剂盒进行检测。收集到的4ml洗脱液中的黄曲霉毒素含量相当于50ml牛奶样品、发酵乳样品或者5g奶粉样品、干酪样品和奶油样品中黄曲霉毒素M1的含量。

如果HPLC检测需要其它溶剂，可以将乙腈洗脱液氮气吹干，然后复溶

【注意事项】

┅┅黄曲霉毒素危害极大，应戴手套操作。

┅┅使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用5%浓度的次氯酸钠溶液浸泡过夜。

┅┅不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。

【贮藏条件及保存期】

贮藏条件：亲和柱2-8℃保存，不可冻存。

保存期：该产品有效期为12个月。