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Explorer 100/10 AKTA 蛋白纯化系统
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详细信息
蛋白纯化技术是生物研究领域的一项重要技术。要研究某一个特殊蛋白质，首先就要将这个蛋白从生物体中分离纯化出来。蛋白纯化方法主要是利用不同蛋白质间的相似性与差异。依据蛋白间的相似性可以去除非蛋白物质，再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出来。
AKTA 蛋白纯化系统
AKTA 蛋白纯化系统
His-tag作为蛋白纯化时的标签，其优势在于：
N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；
采用IMAC（固定化金属离子亲合层析）纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便；
His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；
His-Tag非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；
与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统；
His-Tag融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。
His-Tag亲和层析填料
His-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。
Ni2+在亲和纯化实验中的使用广泛。根据结合基团的不同，Ni2+亲和层析柱可分为俩类——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位，其中Ni-IDA螯合了三价，Ni-NTA螯合了四价。所以IDA的载量要比NTA的高，在同样条件下Ni-IDA洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。
IMAC在通常的情况下是比较稳定的，但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂，如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质。因此，E.coli在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂（通常存在于细菌的细胞周质中），导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化His-Tag融合蛋白的实验时，首先需要去除螯合剂。
Ni-NTA亲和层析实验
Ni-NTA分离带His标签的重组蛋白
Ni-NTA装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；
用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；
将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45um滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；
用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；
用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于低温环境中保存。
缓冲液组成：
缓冲液1
50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g，
加适量水溶解后定容到1000ml。
缓冲液2
50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适量，水调pH后定容到1000ml。
缓冲液3
不同咪唑浓度的缓冲液B配制：
| 咪唑浓度 | 缓冲液1量(ml) | 缓冲液2量(ml) |
| 10mM | 98 | 2 |
| 50mM | 90 | 10 |
| 100mM | 80 | 20 |
| 200mM | 60 | 40 |
| 300mM | 40 | 60 |
| 400mM | 20 | 80 |
咪唑洗脱原理
Ni柱中的氯化镍可以与有His-Tag的融合蛋白结合，也可以与咪唑进行结合，当标签蛋白与层析柱表面珠孔内的
镍离子介质发生结合时，不同浓度的咪唑通过层析柱，就会将与镍配位的标签蛋白，杂蛋白等分别洗脱下来，从而得到高纯度目标蛋白。
附录：Ni-IDA和Ni-NTA的一些参数对比
| 名称 | Ni-IDA | Ni-NTA | |
| 参数 | 指标 | ||
| 基质 | 6%交联琼脂糖凝胶 | ||
| 配基 | 亚胺二乙酸(IDA) | 次氮基三乙酸（NTA） | |
| 粒径 | 45~165 µm | 60~169 µm | |
| 金属离子密度 | 40 µmol/ml | 20-40 µmol/ml | |
| 载量 | 25-30mg蛋白/ml | 15mg蛋白/ml | |
| 柱体积 | 1ml或5ml | 1ml或5ml | |
| 柱尺寸 （内径x高度） | 0.9×1.57cm(1ml柱子) 0.9×1.57cm(5ml柱子) | 0.6cmx2.8cm(1ml柱子) 1.4cmx2.98cm(5ml柱子) | |
| 推荐流速 | 1ml/min(1ml柱子) 5ml/min(5ml柱子) | ||
| 流速 | 4ml/min(1ml柱子) 10ml/min(1ml柱子) | 20ml/min(5ml柱子) 40ml/min(5ml柱子) | |
| 耐压 | 0.3MPa(3bar) | 0.5MPa（5bar） | |
| 避免使用的试剂 | 螯合剂：EDTA、EGTA、柠檬酸等 | >20mM硫化试剂 >10mM DTT 螯合剂：EDTA、EGTA 阴离子去污剂 | |
| pH稳定性 | PH 2-14（短期，2h）；PH 3-12（长期，7天） | ||
