支原体检测试剂盒
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无锡欣润生物科技有限公司是一家致力于为药物公司、卫生防疫机构和科研院所提供符合GLP标准规范的原代细胞及体外药物代谢和药物间相互作用评价的产品公司，并提供以原代细胞为中心的体外药物筛选相关技术服务的高科技企业。
公司拥有多项*成熟的原代细胞分离培养技术，其中肝脏类细胞、成年鼠心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞、胰岛细胞、小鼠骨髓间充质干细胞、肝S9和肝微粒体等特色产品及相关服务获得众多合作伙伴的良好好评。
公司始终以“专注产品，用心服务”为核心价值，致力于打造原代细胞分离培养品牌，为各类药物研发机构提供细胞生物学方面的高质量产品和优质服务。
详细信息
一、支原体检测试剂盒的产品特色：
（1）仅需1μl培养细胞上清液和1台水浴锅，不需要提取基因组DNA，不需要荧光显微镜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、生物发光检测仪等复杂实验设备；
（2）仅需1h出结果，简单快速灵敏的细胞支原体检测方法；
（3）仅需一步操作完成整个实验，实验结果根据反应液颜色变化肉眼直观容易辨别，无需电泳，避免多步操作开盖带来的假阳性风险；
（4）灵敏度远远高于PCR法，能够检测细胞培养中常见的多种支原体（猪鼻支原体、jing氨酸支原体、口腔支原体、莱氏无胆甾原体、发酵支原体、唾液支原体、人型支原体、梨支原体，占支原体污染的98%）。
二、支原体检测试剂盒组成（25T）：
组分 | 规格 |
溶液A | 580μl |
溶液B | 25μl |
阳性对照 | 15μl |
石蜡油 | 700μl |
三、实验步骤：
（1）待测细胞培养液上清准备
待测细胞在培养2-3天且融化度最好达到80%以上时取细胞培养液200μL以上体积，按照200g离心5分钟，然后取上清液进行后续检测（不要取到管底部50μl培养液及细胞沉淀即可）；
（2）反应体系配制（首先将溶液A、溶液B、阳性对照、石蜡油解冻融化后立即放置于冰上）
将溶液A从-20℃取出，待其解冻融化后，上下轻轻颠倒混匀。根据待测细胞样本数量在微量离心管中配制如下反应体系（反应体系配制过程在冰上进行非常重要）；
组分 | 单个样品反应体积（μl） | 样品总数 | 总体积（μl） |
溶液A | 23μl | N | (N+3)*23 |
溶液B | 1μl | N | (N+3)*1 |
备注：每次实验需要1个阴性对照、1个阳性对照及由于移液器存在移液误差，所以检测N个样品一般推荐配制N+3个上述反应体系
用震荡器轻轻混匀，然后分装到PCR管中（推荐使用200μl体积PCR管），每管分装24μl上述混匀后的反应液；
（3）上样（整个上样过程保持冰上进行非常重要，特别是反应液上方覆盖的石蜡油需要冰上预冷）
待测样品：向反应管中加入1μl待测离心后培养液上清，然后用此加液枪上下移动轻轻吹打5次；
阴性对照：不加入任何样品或加入1μl无菌水；
阳性对照：加入1μl阳性对照样品，然后用此加液枪上下移动轻轻吹打5次；
然后每反应管溶液上方轻轻中加入25μl石蜡油（水浴锅中进行反应），以防止液体蒸发导致结果不准确。加入石蜡油时请注意每次更换枪头，防止样品之间交叉污染。如果反应是在PCR仪中进行反应，不需要加入石蜡油。
（4）反应
将水浴锅或PCR仪温度设置成61℃，放入反应管，孵育60min；
备注:
1、水浴锅实际温度可能与设置温度有所偏差，建议先用温度计进行校准。实际上59-63℃反应都可以进行，但会影响检测灵敏度；
2、反应产物不可开盖，否则产生的气溶胶会导致后续检测假阳性的出现。建议将反应管包扎在塑料袋或手套中,丢弃到专用垃圾桶中,并及时清理；
3、不建议使用烘箱或金属浴进行加热反应；
（5）结果判断
61℃反应60min后，立刻取出反应管，放于室温。在光线良好的环境中观察反应结果（建议以白纸为背景）。如果反应液仍为蓝紫色，则判定为阴性；若反应液为天蓝色，则判定为阳性。
四、相关文献
1、ShiyuHe,YanzhiHuang,YanlingZhao.AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease.FrontiersinMicrobiology.2020;12(11):734-743.
2、AudreyJean,FlorenceTardy,OmranAllatif.AssessingmycoplasmacontaminationofcellculturesbyqPCRusingasetofuniversalprimerpairstargetinga1.5kbfragmentof16SrRNAgenes.PLOSONE.2017;12(2):e0172358.
3、ZohreSoheily,MohammadSoleimani,KeivanMajidzadeh-Ardebili.DetectionofMycoplasmaContaminationofCellCulturebyALoop-MediatedIsothermalAmplifcationMethod.CellJ.2019;21(1):43-48.
4、XinXu,XueyuWang,WenHu.AnImprovedPolymeraseCross-LinkingSpiralReactionAssayforRapidDiagnosticofCanineParvovirus2Infection.FrontiersinVeterinaryScience.2020;7(57):1629-1636.
