真核表达载体构建实验服务

一.服务介绍

分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩 增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

二、实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种: T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在--起的功能， 而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步:首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶- AMP复合物;然后,酶一AMP复台物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键， 把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37°C时有利于连接酶的活性但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16°C， 连接12-16h(过夜), 这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

三、实验流程

1.目的DNA的扩增和纯化;

2.连接反应;

3.电泳检测连接产物。

四、客户提供

样本DNA，基因序列,试剂盒。

五、公司提供

构建好的载体，电泳胶图，测序结果。