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商品介绍：

产品特点：

1．采用*的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，减少误差。

2．背景低，灵敏度高，线性范围宽，重复性好。

3．本产品为足够500次(5个96孔细胞培养板)微孔板检测。

4．可用于生物活性因子活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性测定等。

使用方法：

下面操作是检测细胞毒性的试验，其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验)，操作步骤可以以此为基础稍作修改即可，故不再赘述。

㈠、接种细胞

1．按常规胰酶消化法消化汇合的单层细胞，收集到含血清的培养基中。

2．200g离心5分钟收集细胞沉淀。

3．用培养基重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬浮液并计数。

4．将细胞稀释到2.5×103个/mL～5×10个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定)，如果不知道生长数度，一般可以稀释到1×10个/mL。

5．将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。

6．用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞，则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。注意：一定要把细胞加在孔的正中，否则细胞会聚集在孔的角落处，影响试验。

7．用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零)，第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11 列反应的影响。

8．按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天，使细胞进入指数生长期。

㈡、药物处理

9．用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度，则需要预试验确定)，一般一种药物需要做3块平行板。

10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培养基。

11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基，这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。

12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物，每列加入一个浓度的药物。

13．按常规方法把96孔板继续放在在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间，此段时间即为药物处理细胞的时间，由用户自己决定。

14．处理结束后去除第2 到第11列(共10列，均含细胞)所有孔中的培养基，并再加入100μL新鲜培养基。

15．每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。

㈢、存活细胞计数

16．在生长末期，去除第1到第11列各孔中的培养基后，再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分)，用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。注意：溶液A在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解，摇匀后使用。MTT有致癌性，一定要带手套操作。

17．小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收，最好尽可能去除。

18．每孔加入100μL溶液B，置摇床上低速振荡10分钟，使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。

19．由于产物不稳定，故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。

 注意：用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。

20．计数同样处理的各次重复的平均值。

21．以药物浓度为横轴，以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度绝对值差别很大，一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为100%)，这样便于计算出IC50，用于各种药物处理效果的比较。注意：如果测生长曲线，则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型，具有促进作用的则斜率加大。

培养操作步骤：

1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；

2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；

3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；

4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片*浸在培养液中；

5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。

phospho-ATG16A(Ser213)磷酸化自噬相关蛋白16A抗体

phospho-AKT3 (Ser472)磷酸化蛋白激酶AKT3抗体

phospho-ADRB2 (Ser261)磷酸化肾上腺素能受体β2抗体

phospho-AQP2(Ser261)磷酸化水通道蛋白2抗体

phospho-ATG3 (Tyr18)磷酸化自噬相关蛋白3抗体

ALDOB醛缩酶2抗体

AMY2A胰腺α淀粉酶抗体

ANKRD11锚蛋白重复结构域蛋白11抗体

phospho-c-ABL1+2 (Tyr393+429)磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体

phospho-ATF2 (Thr53)磷酸化活化复制因子2抗体

AKR1D1醛固酮还原酶家族1成员D1抗体

ARP4肝血管生成素相关蛋白抗体

ABHD5自水解酶结构域5蛋白抗体

ACOT8酰基硫酯酶8

Agpat2溶血磷脂酸酰基转移酶β抗体

AFP4bAFP4b蛋白抗体

APOC2载脂蛋白C2抗体

Apolipoprotein A V载脂蛋白A5抗体

APOA2载脂蛋白A2抗体

AGPAT4溶血磷脂酸酰基转移酶D抗体

HAVSMC, 人主动脉平滑肌细胞 Human

LX-2, 人肝星形细胞株 Human

3T3-L1, 小鼠前脂肪细胞 Mouse

C2C12, 小鼠肌原细胞 Mouse

细胞名称 种属

MCF-7（MCF7）（ATCC来源）, 人乳腺癌细胞 Human

MDA-MB-231（ATCC来源）, 人乳腺癌细胞 Human

Raji，人Burkitt's淋巴瘤细胞 Human

Saos-2，人成骨肉瘤细胞 Human

Caco-2，人结直肠腺癌细胞 Human

NCI-N87 [N87]人胃癌细胞 Human

MGC80-3（MGC-803）人胃癌细胞 Human

EC109，人食管癌细胞 Human

HGC-27人胃癌细胞 Human

AGS人胃腺癌细胞 Human

U251人胶质瘤细胞 Human

THP-1人单核白血病细胞 Human

HuH-7人肝癌细胞 Human

SK-MEL-1, 人皮肤黑色素瘤细胞 Human

A549, 人肺癌细胞系 Human

SKOV3/Taxol-25, 人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株 Human

A-375 [A375], 人恶性黑素瘤细胞株 Human

A549/DDP, 人肺腺癌耐药细胞株 Human

SP2/0, 小鼠骨髓瘤细胞 Mouse

MTT检测试剂盒WM35, 人黑色素瘤细胞 Human

BxPC-3, 人原位胰腺腺癌细胞株 Human

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织*被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。