一、 FluorCam叶绿素荧光成像技术功能特点

由于叶绿素荧光技术本身在科学研究中有一系列的局限性。因此从上世纪八十年代末开始，随着Charge-Coupled Device(CCD)成像技术、LED光源板技术、图像分析技术的成熟，不断有科学家和工程师合作探索将这三项技术与PAM脉冲调制技术结合，进而将叶绿素荧光技术升级为叶绿素荧光成像技术（Daley et al. 1989; Raschke et al. 1990; Mott et al. 1993; Genty and Meyer 1994; Bro et al. 1995; Siebke and Weis 1995; Meyer and Genty 1998; Balachandran et al. 1994; Oxborough and Baker 1997）。

20世纪90年代末，PSI科学家Nedbal和PSI总裁Trtilek等合作，成功研制了与PAM脉冲调制技术结合的FluorCam叶绿素荧光成像技术（Nedbal et al., 2000），并推出第一台商业化叶绿素荧光成像设备FluorCam。

这一发明正式开启了叶绿素荧光研究的二维时代。FluorCam叶绿素荧光成像技术成为上世纪90年代叶绿素荧光技术的重要突破，使科学家们对光合作用与叶绿素荧光的研究一下子进入二维世界，并得到了国际科学界的一致认可。

与之前的叶绿素荧光技术相比，FluorCam叶绿素荧光成像技术的主要优势有：

· 能够全面反映整株植物、叶片、藻类群体等的不同位置荧光强度变化与分布。

· 可测量叶片、果实、麦穗、大型藻/微藻、整株植物乃至植物冠层等各种样品。

· 可同时测定几十、甚至上百株个样品。

· 能够在显微水平研究叶绿体或藻类细胞。

· 尤其适用于环境胁迫早期植物不同部位光合活性的变化规律、突变体不同部位的光合功能差异等研究。

同时，FluorCam叶绿素荧光成像技术与同类技术相比具备以下优势：

· 由真正的生物学家、数学家、电子工程师和光学工程师组成的研发团队所开发

· FluorCam是脉冲调试式叶绿素荧光成像技术的最早实用化成果

· 国际叶绿素荧光成像技术，仅2019-2021.3可查阅全文的SCI文献就有300篇以上

· 可实现高通量植物表型分析、抗性筛选、种质资源检测等科研应用

· 激发荧光的LED光源板和获取荧光数据的成像传感器不但技术而且为PSI自行开发，具备*自主知识产权

· 测量及成像参数最多，具备叶绿素荧光显微成像、OJIP快速荧光动力学曲线、QA再氧化动力学、荧光蛋白活体成像、多光谱荧光成像、无人值守自动监测、图像阈值分割等世界的成像测量功能

· 以FluorCam叶绿素荧光成像技术为核心的PlantScreen植物表型成像分析系统为目前安装最多的植物表型组学研究系统

· 软件由PSI开发，为客户提供升级服务

· PSI表型科研中心可进行科研合作并提供实验指导

· 系统型号全面，适用于各种实验需求

· 几乎无维护费用

技术功能特点：

1) 仪器型号和配置灵活多样，测量样品涵盖了从叶片、藻类、果实、花朵、整株植物、植物群体/冠层乃至单个微藻/植物细胞、叶绿体等几乎所有不同类型的宏观和微观植物样品，甚至还包括含有叶绿素的细菌和海洋生物；同时满足了从实验室光合机理精细研究到野外大田实地研究，从自然环境到精确可控环境等不同实验条件和尺度的要求。

2) 高灵敏度CCD，时间分辨率可达50帧／秒，分辨率720×560像素；可选配高分辨率CCD，最高分辨率1360×1024像素，在最高图像分辨率下时间分辨率可达20帧／秒，用于稳态荧光如GFP荧光测量等；超高灵敏度成像传感器，最高分辨率1280×1024像素，最高时间分辨率高达16000帧／秒，真正实现了OJIP快速荧光诱导动力学曲线的成像测量

3) 具备完备的自动测量程序（protocol），可自由对自动测量程序进行编辑

a) Fv/Fm：测量参数包括Fo，Fm，Fv，QY等

b) Kautsky诱导效应：Fo，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等荧光参数

c) 荧光淬灭分析：Fo，Fm，Fp，Fs，Fv，QY，Φ_II，NPQ，Qp，Rfd，qL等50多个参数

d) 光响应曲线：Fo，Fm，QY，QY_Ln，ETR等荧光参数

e) PAR吸收率、NDVI成像测量（选配）

f) GFP、YFP、EBFP、CFP、DsRed等荧光蛋白与DAPI等荧光染料的荧光定量测量（选配）

g) 多光谱荧光测量（选配）：F440、F520、F690、F740

h) QA再氧化动力学曲线（选配）

i) OJIP快速荧光诱导动力学曲线（选配）：Fo，Fj，Fi，P或Fm，Mo（OJIP曲线初始斜率）、OJIP固定面积、Sm（对关闭所有光反应中心所需能量的量度）、QY、PI等参数

4) 自动重复实验功能，可无人值守自动循环完成选定的实验程序，重复次数及间隔时间客户自定义，成像测量数据自动按时间日期存入计算机

5) 标配4个LED光源板，采用大型预封装LED光源，红/蓝或红/白双色光化光源，可选配其他不同颜色（波长）、不同光强LED光源

6) 功能强大的FluorCam叶绿素荧光成像分析软件功能：具Live（实况测试）、Protocols（实验程序选择定制）、Pre–processing（成像预处理）、Result（成像分析结果）等功能菜单：

7) 数据分析具备“信号计算再平均”模式（算数平均值）和“信号平均再计算模式”两种功能模式，在高信噪比的情况下选用“信号计算再平均”模式，在低信噪比的情况下选择“信号平均再计算”模式以过滤掉噪音带来的误差

8) 输出结果：高时间解析度荧光动态图、荧光动态变化视频、荧光参数Excel文件、直方图、不同参数成像图、不同ROI的荧光参数列表等

二、 FluorCam叶绿素荧光成像系统型号

1. FluorCam便携式叶绿素荧光成像仪

· 可测量叶绿素荧光成像，可选配GFP荧光蛋白成像功能

· 成像面积：便携式FluorCam 31.5mm×41.5 mm、便携式GFPCam 35mm×46 mm

· 配备专用支架和电池包，便携性强，实验室、野外均可使用

· 可编辑测量实验程序（protocol）

· 具备自动重复测量功能

· 配备专用暗适应叶夹，便于在野外对样品进行暗适应无损测量

2. FluorCam封闭式叶绿素荧光成像系统

· FluorCam系列中功能全面，使用便捷的型号

· 系统集成于暗适应操作箱内，操作简便、便于移动，既可在实验室内也可在室外进行暗适应成像测量分析

· 高灵敏度CCD镜头，时间分辨率达50张每秒，快速捕捉叶绿素荧光瞬变；可选配高分辨率CCD用于稳态荧光如GFP荧光测量；也可选配超高灵敏度成像传感器，实现真正的OJIP快速荧光诱导动力学曲线成像测量

· 成像面积达13×13cm，可对植物叶片、植物组织、藻类、苔藓、地衣、整株植物或多株植物、96孔板、384孔板等进行成像分析

· 饱和光光强最高达6000 µmol(photons)/m².s，进行QA再氧化分析使用的单周转饱和光闪STF可达120000µmol(photons)/m².s

· 世界上可进行OJIP快速荧光动力学成像分析的叶绿素荧光技术设备

· 世界上可进行QA再氧化动力学成像分析的叶绿素荧光技术设备

· 具备功能的、可编辑的叶绿素荧光实验程序（Protocols），包括快照模式、Fv/Fm、Kautsky诱导效应、叶绿素荧光淬灭分析、LC光响应曲线、PAR吸收与NDVI成像分析、QA再氧化动力学分析、OJIP快速荧光动力学分析及GFP绿色荧光蛋白成像等

· 可选配GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等荧光蛋白与荧光染料成像

· 可进行自动重复成像测量分析

· 4块大型高强度封装LED光源板，具备双色光化光，标配为2红光+2白光，可选配2红光+2蓝光或其它波长光源组合

3. FluorCam开放式叶绿素荧光成像系统

· 模块化设计，配置灵活，可自由安装更换光源板、自由调整光源角度和高度、自由调整CCD镜头高度，方便被测植物的处理、操作等

· 4块大型高强度封装LED光源板，具备双色光化光，标配为2红光+2白光，可选配2红光+2蓝光或其它波长光源组合

· 可自由选配多种备用不同波长LEDs光源板，用户可简便自行更换，如选配青色光源板用于气孔功能研究、选配紫外光源板用于多光谱荧光成像测量等

· 可进行GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等荧光蛋白与荧光染料成像

· 标准版成像面积13×13cm，大型版成像面积达20×20cm，可对整株植物甚至多株植物（如拟南芥等小型植物）进行实验成像分析

· 高灵敏度CCD镜头，时间分辨率达50张每秒，快速捕捉叶绿素荧光瞬变，可选配高分辨率CCD用于稳态荧光如GFP荧光测量

4. FluorCam多光谱荧光成像系统

FluorCam多光谱成像系统是将稳态荧光成像技术与脉冲调制式叶绿素荧光成像技术融于一体，能够在一台仪器上实现GFP、BFP、CFP、YFP、RFP等荧光蛋白成像、DAPI等荧光染料成像、荧光素酶、脉冲调制式叶绿素荧光成像以及NDVI反射光谱成像分析功能，是真正功能全面的植物荧光活体成像系统。同时，除了植物样品外，植物荧光活体成像系统也可以进行藻类、珊瑚共生体、菌落乃至动物的荧光成像分析。

· 1360×1024像素高分辨率CCD，可对样品荧光标记的分布进行精准成像分析

· 标准版成像面积13×13cm，大型版成像面积达20×20cm，可对整株植物甚至多株植物（如拟南芥等小型植物）进行实验成像分析

· 专用荧光激发光源组与滤波器组合，精确测量不同荧光蛋白标记

· 软件配置多种用户自定义调色板，可生成真实色彩成像图或对比增强彩色成像图

· 可选配新型FluorCam-Pro植物多光谱荧光成像系统，一体化完成各种荧光成像测量  

5. FKM多光谱荧光动态显微成像系统

· 目前用于植物/藻类显微叶绿素荧光成像研究的成熟商用仪器

· 内置现今叶绿素荧光研究的全部程序，如Fv/Fm、Kautsky诱导效应、荧光淬灭、OJIP快速荧光响应曲线、QA再氧化等，可获得70余项参数

· 配备10倍、20倍、40倍、63倍和100倍专用生物荧光物镜，可以清晰观测到叶绿体及其发出的荧光

· 激发光源组中包括红外光、红光、蓝光、绿光、白光、紫外光和远红光等，通过红蓝绿三色光还可以调出可见光谱中的任何一种色光，能够研究植物/藻类中任何一种色素分子或发色团。

· 可进行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等荧光蛋白、荧光染料的成像分析

· 高分辨率光谱仪能够深入解析各种荧光的光谱图

· 控温系统可以保证实验样品在同等温度条件下进行测量，提高实验精度，也可以进行高温/低温胁迫研究

6. FluorCam大型叶绿素荧光成像平台

· 世界上单幅成像面积最大的脉冲调制式（PAM）叶绿素荧光成像系统，成像光源板面积70×70cm，成像面积达35×35cm，可对整株植物及多株植物同时进行非损伤性叶绿素荧光成像分析

· LED激发光源、CCD叶绿素荧光成像镜头及滤波轮等集成于一个高度可自由移动的成像平台上，成像平台高度可调，以适应于不同高度的植物成像分析

· 可选配PAR吸收／NDVI成像分析模块，对植物PAR吸收及光谱反射指数NDVI进行成像分析

· 可选配RGB成像分析模块,用于植物形态测量分析等

· 可选配GFP绿色荧光蛋白成像分析功能，用于植物转基因研究

三、FluorCam叶绿素荧光成像系统应用案例

1. 拟南芥叶绿体R-loop调控机制

2017年清华大学生命学院孙前文课题组通过分析获得一个新的定位于叶绿体中的核糖核酸酶H蛋白（AtRNH1C），发现该蛋白可以调节叶绿体中R-loop水平的变化，从而维持基因组的稳定性和发育。他们使用FluorCam封闭式叶绿素荧光成像系统，发现AtRNH1C对叶绿体的发育有重要作用。

在使用喹诺酮类药物环丙沙星（CIP）处理后，通过FluorCam叶绿素荧光成像图可以直观发现野生型的生长被抑制，同时叶片变色。而atrnh1c突变体则加强了CIP的毒害效应。这更加证实了AtRNH1C的功能。本实验的荧光成像检测是在易科泰Ecolab实验室完成的。

2020年，孙前文课题组又使用FluorCam封闭式叶绿素荧光成像系统结合分子实验结果，证实了R-loop解旋酶过表达能够拯救由于异常累积HO-TRC触发R-loop共同表达造成的缺陷，从而维持拟南芥叶绿体基因组完整性。

参考文献：

1. Yang Z, et al. 2017. RNase H1 Cooperates with DNA Gyrases to Restrict R-loops and Maintain Genome Integrity in Arabidopsis Chloroplasts. The Plant Cell, doi:10.1105/tpc.17.00305

2. Yang Z, et al. 2020. RHON1 Co-transcriptionally Resolves R-Loops for Arabidopsis Chloroplast Genome Maintenance. Cell Reports 30: 243–256

2. 构建耐盐生菜品种表型鉴定体系

目前，全球农业都受到土壤和灌溉水盐分升高的威胁。大约50%的灌溉农田都受到了盐分的影响。2013年的经济分析指出由于盐分诱发的土壤退化和作物产量损失在全球造成了273亿美元的损失。作为一种重要的蔬菜作物，生菜（Lactuca sativa L.）在世界范围内都进行了广泛的种植。生菜产量最高的国家为美国、欧盟和中国。而生菜对盐分胁迫非常敏感的。盐分胁迫会造成生菜生物量减少、诱发叶烧病和早衰等。

美国农业部（USDA）的科学家尝试确定生菜盐胁迫的关键生理表型性状，用于筛选高耐盐的生菜品种，希望从这些数据中筛选出的指标构建耐盐生菜品种表型鉴定体系。与传统作物表型测量相比，一方面光系统对各种生物和非生物胁迫因素都非常敏感，而叶绿素荧光成像分析可以无损地直接测量胁迫对光系统的损伤程度和机理，在胁迫初期乃至症状出现前即可检测到胁迫的发生；另一方面，叶绿素荧光成像分析技术与自动传送系统集合，能够实现对大量样品的高通量无损快速检测，非常适用于作物品种的筛选。他们使用的PlantScreen XYZ植物表型成像分析系统就能够将这两方面的优势地结合起来。其样带式FluorCam叶绿素荧光成像单元是目前使用脉冲调制式叶绿素荧光成像技术实现大型整株植物测量的商用化仪器。自动传送系统可以自动调整成像单元的位置与高度，结合专用软件可以对几十株乃至上百株样品进行自动叶绿素荧光成像分析。

实验中使用了球生菜、奶油生菜、直立生菜、叶生菜等不同的栽培品种和生菜的野生亲缘种L. serriola L，共240株样品。这些品种中既有耐盐品种，也有盐胁迫敏感品种。所有样品在同样盐胁迫处理下进行了叶绿素荧光成像分析。研究者重点分析了QY_max（Fv/Fm）最大光化学效率、Fv/Fm_L（Fv’/Fm’）光适应最大光化学效率、NPQ非光化学淬灭（最大荧光）、qN非光化学淬灭（可变荧光）、qP光化学淬灭、QY实际光化学效率（量子产额）、Rfd荧光衰减比率等荧光参数。

值得一提的是，叶绿素荧光成像图经过校准后，还可以直接获得整株植物具备光合活性的叶面积。结合荧光参数还可以对叶面积进行不同胁迫程度的定量分级和图像分割。本研究中直接使用叶绿素荧光成像获得的光合活性叶面积取代了传统测量的叶面积。

荧光数据与鲜重等传统表型数据进行了相关性分析和主成分分析，结果表明敏感栽培种的叶绿素荧光特征是低QY，qN，NPQ和Rfd，而耐受栽培种的特征是高QY_max，Fv/Fm_L和QY_D。与叶绿素荧光参数的高灵敏度相比，大多数样品的叶绿素指数和CO₂同化速率在盐胁迫处理前后都没有表现出显著的差异。因此，研究者建议在筛选高耐受品系时以较高的叶面积配合较高的Fv/Fm和QY作为初筛指标。

后续，美国农业部又使用加装了高光谱成像单元的PlantScreen表型成像系统与FluorCam结合，通过叶绿素荧光成像数据与高光谱成像数据绘制了生菜水分胁迫响应基因位点的分子图谱。

参考文献：

1. Adhikari N D, et al. 2019. Phenomic and Physiological Analysis of Salinity Effects on Lettuce. Sensors, 19: 4814

2. Kumar P, et al. 2021. Molecular Mapping of Water-Stress Responsive Genomic Loci in Lettuce (Lactuca spp.) Using Kinetics Chlorophyll Fluorescence, Hyperspectral Imaging and Machine Learning. Front. Genet. 12: 634554