产品编号：DG1001-2

包装规格：4 x 96孔板

试剂盒组成

保存方法

本试剂盒应在室温(15~25℃)干燥条件下保存。

产品介绍

本试剂盒可从样品中快速提取总 RNA。可从培养的动物细胞、动物组织中提取总RNA。

本试剂盒提供了一套缓冲液系统，无需BF/氯仿抽提，并提供吸附柱。提取的RNA可用于mRNA分离、探针制备、RT-PCR、Northern blot、引物延伸、RNA酶保护实验和体外翻译等。操作简单快速，总RNA的提取不超过1小时。

产品特点

1. 小于1小时内提取出总RNA。

2. 提取的总RNA质量高，无基因组DNA污染。

3. 得率高，重复性好。

4. 无需BF/氯仿抽提或乙醇沉淀。

应用

从动物组织中可纯化出至多20 μg 的总RNA。纯化的RNA可直接用于任何后续实验，包括：

ü   RT-PCR

ü   实时荧光定量PCR

ü   差异显示

ü   cDNA合成

ü   Northern, dot 和slot blot 分析

ü   引物延伸

ü   Poly A + RNA 筛选

ü   RNase/S1 核酸酶保护实验

ü   微阵列

用户需自备的材料

ü   离心速度至少达到~5600×g的离心机（2 x 96水平转子）

ü   RNase-Free 的多通道移液枪和枪头

ü   RNase-Free 的乙醇(96%以上)

ü   RNase-Free 的乙醇(70%)

ü   14.5M β-mercaptoethanol (β-ME,可选)

ü   DNase I(可选)

试剂准备

每次使用前检查 CLB Solution 是否出现沉淀。如出现沉淀，将溶液于56℃温浴使沉淀溶解，降至室温后再使用。

提供的 WBII Solution 为浓缩液。Shou次使用时，50 ml WBII Solution中应加入200 ml 乙醇，以配制成工作液。

注意：产品仅用于基础科学研究，不可用于人类或动物！

标准操作步骤

1. 样品准备

培养的细胞

1a. 悬浮细胞：取不超过5 x 10⁵的细胞，分别加入细胞培养板的每个孔，~300 x g离心，离心后移除细胞培养基。

1b. 单层细胞：移除细胞培养基。

细胞培养基的去除将在随后的步骤中会稀释CLB Solution，抑制裂解和RNA与纯化板膜的结合。这将导致产量下降。

2. 加入150 μl CLB Solution到细胞培养孔中。用多通道移液枪反复吹打5-6次，使细胞充分裂解。

吹打过程中应避免产生过多气泡。

3. 每孔加入150 μl RNase-Free 的乙醇(70%)，用多通道移液枪吹打3次，混匀。

4. 将96孔总RNA纯化板置于96孔深孔板上。

5. 将裂解液全部转移至96孔RNA纯化板中，覆盖透气膜。

板密封后离心，防止交叉污染。

6. 6000 rpm（~5600 x g）室温离心4min，离心后倒出下层深孔板中的滤液。

7. DNaseI处理基因组DNA（可选）。

通常不需要DNase I消化，因为RNA纯化板中的二氧化硅膜技术在没有DNase处理的情况下有效地去除了大部分DNA。然而对于对非常少量的DNA敏感的某些RNA应用来说，进一步的DNA去除可能是可取的。

8. 取下透气膜，向96孔总RNA纯化板的每个孔中加入600 μl WBI Solution，覆盖透气膜。

9. 6000 rpm（~5600 x g）室温离心4min，离心后倒出下层深孔板中的滤液。

10. 取下透气膜，向96孔总RNA纯化板的每个孔中加入600 μl WBII Solution，覆盖透气膜。

11. 6000 rpm（~5600 x g）室温离心4min，离心后倒出下层深孔板中的滤液。

12. 重复一次步骤10~11。

13. 将96孔总RNA纯化板重新放回深孔板中，6000 rpm（~5600 x g）室温离心5min。

14. 小心取出96孔总RNA纯化板，放入96孔总RNA收集板中，取下透气膜，室温凉置5min，使乙醇挥发。

15. 向96孔总RNA纯化板中加入30~50 μl H2O RNase-Free，覆盖新的透气膜，室温静置2min。

16. 6000 rpm（~5600 x g）室温离心4min。

17. 重复一次步骤15~16。

为了回收RNA，需要重复洗脱步骤，但RNA浓度液会相应降低，请根据实验需要选择合适的洗脱体积。洗脱体积将比添加到膜中的RNase游离水的体积小15μl，对应于膜的死体积。

18. 取下96孔总RNA纯化板，使用密封膜覆盖保存。

离心管中的溶液为RNA样品，可直接用于后续分子生物学实验或保存于-70°C。

注意事项

样品用量

常见问题指南

1. RNA 中有DNA污染

A． 减少原始材料用量。

B． 对于一些DNA含量非常高的组织（比如胸腺），请尝试使用更少的样品。

2. RNA 得率低

A． 我们推荐使用新鲜样品。

B． 将细胞裂解，保证RNA充分释放。

C． 使用适量样品。RNA得率取决于样品的类型、大小、年龄和保存方法。请参考说明书的推荐用量。

D． 检查 WBII Solution 是否已加入无水乙醇。

E.  请严格参照说明书对样品进行洗脱。

3. RNA 降解

A． 在 RNase-Free 的环境中操作。

B． 所有操作步骤中都佩戴手套。经常更换手套。

C． 推荐使用RNase-Free的移液器及吸头。

D． 细胞裂解过程置冰上操作。

4. 吸附步骤中样品成团。

A． 确保样品加入RNA纯化板前已被裂解。

C． 减少样品使用量。根据说明书使用适量大小的样品。

D． 检查 CLB Soluion，如果保存过程中出现沉淀，加热至56°C 使沉淀溶解，降至室温后使用。

5. 抑制后续实验。

A． 来源于WBII Solution 的残留乙醇会抑制后续实验的酶促反应。RNA纯化板~5600 × g 离心2 min，取覆膜后室温静置5 min，使RNA纯化板中吸附膜上残留的乙醇挥发。

B． 残留盐离子会抑制后续实验的酶促反应。确保洗涤步骤在室温下操作。