Toledo 人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞

细胞介绍

Toledo是1990年从患有弥漫性大细胞淋巴瘤(非霍奇金B细胞)的成年白人女性患者的外周血中分离的B淋巴细胞系。经过大剂量化liao和骨髓移植后，患者随后出现脑部淋巴瘤。尽管细胞的形态类似于伯基特淋巴瘤，但细胞缺乏伯基特淋巴瘤的典型染色体易位。核型确实表现出多种染色体畸变。细胞不表达表面或细胞质免疫球蛋白。这些细胞对 Epstein-Barr 病毒呈阴性。

细胞特性

1） 来源：成年白人女性 外周血中分离的B淋巴细胞

2） 形态：淋巴母细胞样  悬浮生长

3） 含量：>1x106 细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5）用途：仅供科研使用。

运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完quan培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完quan培养基来培养细胞。  收到细胞后一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

Toledo 人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞

一．培养基及培养冻存条件准备

1） 准备RPMI-1640（推荐iCell-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

注意：用推荐的wan全培养基重悬细胞沉淀，并分配到T25培养瓶中。在细胞回收过程中避免培养基碱度过高非常重要。建议在添加小瓶内容物之前，将含有wan全生长培养基的培养容器放入培养箱中至少 15 分钟，以使培养基达到正常 pH 值（7.0 至 7.6）。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完quan培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完quan培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完quan培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白mei-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化直至细胞层分散（通常在 5 至 15 分钟内）以使培养基达到正常 pH 值（7.0 至 7.6），然后在显微镜下观察细胞消化情况，为避免结块，在等待细胞分离时请勿敲击或摇动烧瓶来搅动细胞。难以分离的细胞可置于37°C以利于分散。若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的wan全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。