梭状芽孢杆菌是一种复杂的具有多样性的细菌群，主要是由能形成孢子的革兰氏阳性、厌氧、杆状细菌组成。梭状芽孢杆菌在长时间内因肉毒梭菌（Clostridium botulinum）中毒、破伤风梭菌（Clostridium tetani）感染和产气芽孢梭菌（Clostridium perfringens）引起食物中毒等原因，被划分在有害菌群中。但随着研究的深入，发现丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)等产生的有益代谢物，不仅可以推动可再生能源相关主题研究的发展，还可以促进肠道稳态，保障人体健康。但梭菌的低转化效率以及合成生物学工具和遗传部件的匮乏使得梭状芽孢杆菌属进行代谢工程非常困难。因此，随着梭状芽孢杆菌的关注度度越来越高，对成熟遗传转化方法的需求也越来越迫切^[1]。

复制子（Replicon）是复制质粒的关键元件，它可以影响质粒拷贝数和遗传稳定性，进而对基因表达、宿主代谢和最终产物形成产生巨大影响。目前在梭菌的研究中主要选择的方式是结合转移，因此在载体设计上必须同时兼顾革兰氏阴性复制子和革兰氏阳性复制子^[2]。本文主要介绍四种常见梭菌复制子在梭菌遗传转化中的历史和作用。

在梭菌的研究上，1981年Minton等人从丁酸梭菌中分离并鉴定了具有复制功能的pCB102复制子； 1986年Monod等人从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分离得到复制子pIM13； 1998年Davis等人从肉毒梭菌中分离并初步鉴定了pBP1的复制功能，随后在2006年，Pennington等人发现pPB1在生孢梭菌（Clostridium sporogenes）中同样具有复制功能。2002年Purdy等人从艰难梭菌（Clostridium difficile）中分离并鉴定到复制子pCD6。在已发现并得到的复制子基础上，为使整个转化体系更规范和统一，针对不同的复制子改造了不同的梭菌专用质粒。如：质粒PMTL82151的复制子是pBP1; 质粒PMTL83151的复制子是pCB102；质粒PMTL84151的复制子是pCD6；质粒PMTL85151的复制子是pIM13^[3]。

为了解不同复制子和筛选抗性在不同梭菌中的作用，Heap等人在2009年采用具有不同复制子的质粒和筛选抗性对肉毒梭菌、丙酮丁醇梭菌和艰难梭菌进行转化。结果表明，在结合转移的筛选过程中，主要选择catP；ermB；aad9和tetA四种基因对应抗生素，其中 catP和ermB的适用范围相对更普遍(Table 5)。肉毒梭菌在带有pBP1和pCB102复制子的转化体系中，获得阳性克隆的效率远高于pCD6和pIM13。丙酮丁醇梭菌和艰难梭菌在转化过程中对复制子的偏好并不显著（Table 3）。对获得的转化子进行稳定性测试，发现丙酮丁醇梭菌在pBP1复制子体系下，稳定性高达99.4 ，但在pCB102复制子体系下稳定性只有76.5（Table 4）。该文献的报道，有利于后续梭菌转化实验中确定筛选抗性和相应的复制子（图片数据来源于文献）^[4]。2011年，Yu等人在Heap的研究基础上，将四种只存在复制子差异的质粒从大肠杆菌中通过结合转移的方式转到酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）中，发现转化效率从110^-7-3.310^-6，呈现显著性差异，pBP1复制子在酪丁酸梭菌中的转化效率和稳定性均是更好^[5]。因此，选择合适的复制子在梭菌的遗传转化研究上具有重要意义。

综上所述：在梭菌的遗传转化上，提高对不同梭菌所需复制子和筛选抗性的关注，确定合适的复制子和筛选抗性，有利于获得高转化效率和高稳定性的转化子，用于后续的实验研究。本公司目前已成功改造可以在大肠杆菌和梭菌中同时具有复制功能，带有pCD6或pBP1复制子的质粒，达到利用结合转移方式进行梭菌改造的基础条件。同时我们拥有成熟的质粒改造体系，可以针对不同梭菌进行特异的抗性基因选择，达到高效改造梭菌的目的。

锐志魔方生物具有多年的梭菌培养及基因改造经验，目前保存及培养以下菌株：

（1）     ATCC 29065 Clostridium leptum. 柔嫩梭菌

（2）     ATCC BAA-442 Clostridium sp

（3）     ATCC TSD-25 Clostridium sp:Strain:KNHIs219

（4）     ATCC TSD-34 Clostridium sp:Strain:ASB410

（5）     DSM 10702 Clostridium butyricum 丁酸梭菌

锐志魔方生物可为用户提供以下实验定制服务：         

（1）     承接各类梭菌分离培养实验；                  

（2）     承接梭菌过表达株构建服务；                    

（3）     承接梭菌敲除株构建服务；                      

（4）     承接梭菌转座子突变体文库构建、筛选。             

参考文献：

[1]Charubin K, Bennett RK, Fast AG, Papoutsakis ET. Engineering Clostridium organisms as microbial cell-factories: challenges & opportunities[J]. Metab Eng. 2018;50:173-191. 

[2]Minton NP, Ehsaan M, Humphreys CM, Little GT, Baker J, Henstra AM, Liew F, Kelly ML, Sheng L, Schwarz K, Zhang Y. A roadmap for gene system development in Clostridium[J]. Anaerobe. 2016;41:104-112. 

[3]Nogle R, Nagaraju S, Utturkar SM, Giannone RJ, Reynoso V, Leang C, Hettich RL, Mitchell WP, Simpson SD, Jewett MC, Köpke M, Brown SD. Clostridium autoethanogenum isopropanol production via native plasmid pCA replicon[J]. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:932363. 

 [4]Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids[J]. J Microbiol Methods. 2009;78(1):79-85. 

[5]Yu M, Du Y, Jiang W, Chang WL, Yang ST, Tang IC. Effects of different replicons in conjugative plasmids on transformation efficiency, plasmid stability, gene expression and n-butanol biosynthesis in Clostridium tyrobutyricum[J]. Appl Microbiol Biotechnol. 2012 ;93(2):881-9.