1、没有产物

➤   遗漏了PCR试剂，重复PCR反应，但要进行核对，以确保所有成分都加入。

➤   引物设计不良，重复引物设计过程，再次检查引物特异性，尝试增加引物长度，或采用不同的设计方法。在文献或数据库中搜索能扩增预期DNA片段的有效引物。

➤   引物不足，确认引物储备准备正确。通过改变引物的浓度来重复测试；通常的范围是0.05 ~ 1 μM。

➤   引物质量差，引物可能是旧的或退化的。用纳米滴定仪检查其质量，用新鲜引物替换。

➤   模板质量差，用凝胶电泳分析质粒，用纳米滴管的A260/280比率分析质粒和gDNA，以评估其质量。进一步纯化模板DNA。

➤   复杂模板，除非使用特殊的聚合酶，否则从富含GC的片段或较长的模板进行扩增可能是次优的[7]。模板浓度在质粒（每50μL反应1pg10 ng）和gDNA（每50μL反应1 ng-1μg）之间的扩增有所不同。

➤   次优的盐条件，镁阳离子（Mg2+）作为聚合酶的辅助因子；因此，低镁盐水平会降低聚合酶的活性。用不同的镁盐浓度进行一系列测试PCR反应，以确定水平。另外，在解冻镁盐储备时要涡旋，以重新悬浮储存时沉淀的任何盐。

➤   存在反应抑制物或污染物，进一步纯化模板DNA，高压灭菌PCR管，或使用新鲜试剂。

➤   循环不足，用不同的循环进行测试PCR反应，以确定理想的数量。

➤   延伸时间不足，如果没有给聚合酶足够的时间来扩增DNA，那么就不会有产物。核实制造商的聚合酶速率，并计算出足够长的延伸时间，以使DNA得到扩增。

➤   不正确的PCR程序，检查是否使用了正确的程序，或者正确的程序没有被无意中改变。核实PCR程序并重复PCR反应。

➤   退火温度不正确，退火温度可能太高。检查所设计的引物的预期Tm，通过使用退火温度梯度进行测试。

➤   退火时间不正确，退火时间可能太短；没有给引物足够的时间与模板结合。

➤   阻断温度不正确，如果阻断温度不正确，退火、延伸和熔化温度将不准确。为了纠正，请进行加热块校准。

2、结果微弱

➤   引物不足，引物质量差，模板质量差，模板复杂，盐条件不理想，存在反应抑制剂或污染物，循环不足。

➤   脱氧核苷三磷酸酯（dNTPs）降解，dNTPs可能因反复冻融循环而降解。等分库存以减少降解。

➤   不正确的变性温度，变性温度可能太低；模板融化不理想，导致扩增效率低。

➤   不正确的变性时间，变性持续时间可能太短；没有给模板足够的时间熔化，导致扩增效率低。

3、不正确或非特异性产物

➤   引物设计不正确，引物没有设计成能扩增所需的DNA片段，导致产物大小不正确。重新设计引物以扩增正确的片段。当出现非特异性条带时，增加引物长度以加强模板结合，尽量减少错误引物。

➤   引物缺乏特异性，检查引物在模板DNA中是否有额外的互补区域。

➤   引物过量，检查确定引物储备的制备是否正确。通过改变引物浓度来重复试运行；通常的范围是0.05-1μM。

➤   模板浓度不正确，从质粒（每50μL反应1pg-10ng）到gDNA（每50μL反应1ng-1μg）的扩增，模板浓度不同。检查模板浓度并调整PCR反应的体积。运行测试反应以确定浓度。

➤   次优的盐条件，镁离子可增强引物与模板结合的稳定性，增加引物与不互补的模板序列的亲和力。用不同的镁盐浓度进行一系列的测试PCR反应，以确定水平。另外，在解冻镁盐浆时，涡旋，以重新悬浮任何可能在储存时沉淀的盐。

➤   不正确的退火温度，如果退火温度太低，可能会发生误吸，导致大小不一的条带。

➤   不正确的退火时间，退火时间可能太长；使引物有更多的时间与模板发生误植。

➤   过早复制，在冰上准备PCR反应，使用热启动聚合酶，并将PCR机预热到变性温度。

➤   外源性DNA的污染，使用新鲜试剂，在专门的净化区工作。

➤   核酸酶污染，使用新鲜试剂重复PCR反应。

4、序列错误

➤   低保真聚合酶，低保真度的聚合酶比高保真度的聚合酶更频繁地发生复制错误。

➤   循环次数太多，不必要的循环会增加聚合酶出错的可能性。进行测试反应以确定所需的最小循环次数。

➤   不理想的盐条件，降低PCR反应中的镁盐浓度。

➤   降解或不平衡的dNTPs浓度，等分dNTP储备以减少冻融循环造成的降解；确保储备中含有等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。PCR反应的dNTP含量可能过高，用较低的浓度测试反应条件。

➤   模板质量差，模板可能在纯化过程中被剪切或缺口，或因紫外线照射而损坏。准备新鲜模板并重复PCR反应。

➤   降解的PCR产物，如果PCR产物在凝胶中切除条带之前在紫外光下被成像，那么它可能被损坏。重复PCR反应，但要限制紫外线照射，并加快工作速度以切除条带。