jenabioscience:Atto 425蛋白质标记试剂盒

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一组科学家于1998年成立，利用超过25年的学术知识为100多个国家的研究和行业客户开发创新试剂。

供一般实验室使用。

运输:凝胶包装运输

储存条件:储存在-20°C
避光储存，参见手册

保质期:12个月

光谱特性:
激发最大值:λexc= 436纳米发射最大值:λ全身长的= 484纳米消光系数:ε最大= 45000摩尔-1厘米-1校正系数:CF280纳米 = 0.23

描述:
荧光技术已经成为生物科学的主要工具。荧光蛋白如GFP和DsRed融合到感兴趣的蛋白(POI)允许表达分析和体内蛋白定位。然而，由于这些融合蛋白的大分子量，它们的应用受到限制。此外，相关的分子生物学是乏味和耗时的。
共价连接到POI上的小荧光团可能有助于克服这个问题。半胱氨酸巯基的荧光标记对于研究POI的结构、功能和相互作用是优选的。(请注意:Jena Bioscience提供了一个即用型试剂盒，用于用高质量的小荧光团标记半胱氨酸残基(Cat。# FP-202)用于蛋白质活性和功能研究)。
然而，最常见的蛋白质标记方法是胺修饰。胺反应性荧光团如NHS-酯容易与N-末端[1]以及赖氨酸侧链上的伯氨基反应，形成稳定的共价键。
这种Jena Bioscience蛋白质标记试剂盒设计用于用小荧光团标记POI的赖氨酸，产生荧光蛋白质-荧光团缀合物。它包含对1mg POI进行10次单独标记反应所需的所有试剂。

内容:
atto 425 NHS-酯
1瓶含1毫克

二甲基甲酰胺
200微升

碳酸氢钠
1瓶含84毫克

超纯水
1毫升

储存和稳定性:
收到后，将染料储存在-20°c下。其他成分可储存在室温下。如果按照建议储存，Jena Bioscience保证该产品在12个月内保持最佳性能。

协议:
一般注意事项
最佳蛋白质浓度为10 mg/ml，其他浓度也是可能的，然而，它应该至少为2 mg/ml，因为标记效率受到较低蛋白质浓度的影响。我们建议每个标记反应使用大约1毫克蛋白质。
含有伯胺如Tris和甘氨酸的缓冲液不适用于标记反应，必须在开始标记反应前用合适的不含胺的缓冲液如PBS、MES或HEPES替换。

实验协议

• 加入1毫升超纯水溶解碳酸氢钠。得到的1 M溶液在4°C下至少稳定2周。
• 向蛋白质溶液中加入适量的碳酸氢钠(1 M ),使最终浓度达到100 mM
• 通过添加100 μl DMF制备染料，使染料浓度达到10 mg/ml。涡旋直至NHS酯*全溶解！我们建议在使用前立即制备溶液，然而，它在-20°c下可稳定保存两周。无论何时处理荧光团或共轭物，请在弱光条件下工作！
• 将100微升蛋白质溶液(10毫克/毫升)和10微升染料(10毫克/毫升)加入适当的小瓶中。小心涡旋并短暂离心，收集试管底部的反应混合物。
• 室温下在摇床中培养一小时。避光！
• 使用标准凝胶过滤柱如Sephadex G-25或类似物纯化缀合物。或者，可以通过透析或合适的自旋浓缩器将游离染料从缀合物中分离出来。

请注意，该套件不提供蛋白质纯化材料！

共轭物的浓度
因为在标记过程中，特别是在纯化过程中，可能会发生一定的蛋白质损失，所以测量缀合物的浓度对于进一步的应用是重要的。蛋白质的浓度通常通过测量其在280 nm处的吸光度来确定。然而，如Atto 425的激发光谱所示，荧光染料也在280 nm处吸收，从而增加了λ280对于共轭。因此，需要一个校正系数(CF)来消除280 nm处染料的影响。
每种染料的CF在光谱数据部分给出，因此缀合物的浓度根据下式计算:

c(毫克/毫升)= ((A280［构成动植物的古名或拉丁化的现代名］最大x CF) / ε280)x MW蛋白质

标记度
DOL表示每分子缀合物中荧光团分子的平均数。它是共轭物的一个重要参数，显著地影响进一步的应用。对于大多数目的，每200个氨基酸大约1个荧光团分子的DOL是理想的，也参见故障排除部分。
DOL的计算公式如下:

DOL = (A最大x ε280)/ ((A280［构成动植物的古名或拉丁化的现代名］最大x CF) x ε最大)

测定用Atto 488 NHS酯标记的BSA(牛血清白蛋白)的结合物浓度和DOL的实例:
牛血清白蛋白:ε280= 42925米-1厘米-1，MW = 66，433 Da
Atto 488: λexc= 501纳米，ε最大= 90，000米-1厘米-1，CF = 0.1

标记和纯化后，分别在280和501 nm测量结合物溶液的吸收。

计算缀合物浓度和DOL:

c(毫克/毫升)= ((A280［构成动植物的古名或拉丁化的现代名］最大x CF) / ε280)x MW蛋白质
c(毫克/毫升)=((1.69-7.23 x 0.1)/42925)x 66433
c(毫克/毫升)= 1.5

DOL = (A最大x ε280)/ ((A280［构成动植物的古名或拉丁化的现代名］最大x CF) x ε最大)
DOL =(7.23 x 42925)/((1.69-7.23 x 0.1)x 90000)
DOL = 3.57

在该实验中，缀合物的浓度为1.5 mg/ml，大多数蛋白质分子用三个或四个Atto 488分子标记，相当于每200个氨基酸有1.2个Atto 488分子。
请注意，结合物的浓度和DOL的光谱测定不是绝对正确的。游离染料的光谱特征与结合到POI的染料的光谱特征不全相同。此外，天然蛋白质在280 nm处的光谱特征不同于缀合物的光谱特征。
一般来说，这些变化小得可以忽略不计，因此，光谱测定结合物的浓度和DOL是*常用的方法[3]。
除了光谱测量之外，可以通过SDS-PAGE和随后的凝胶荧光扫描来分析缀合物。在荧光扫描中应该只有一条带(由荧光标记的蛋白质组成)可见。如果在非常低的分子量下有一个额外的带，结合物溶液仍然含有游离染料，必须再次纯化。

结合物的储存
避光！像未标记的蛋白质一样储存结合物。我们建议将溶液分成小份，并在-20°C或-80°C下冷冻。避免反复冷冻和解冻！

故障排除:
低效标记

• 蛋白质溶液的浓度

  
  

  该分析被优化用于标记浓度为10 mg/ml的1 mg蛋白质。

  
  

  蛋白质浓度高于10毫克/毫升时，按比例增加染料量。如果您的蛋白质浓度非常低(< 1毫克/毫升)，请使用旋转浓缩器以达到2毫克/毫升的最终浓度。

  
  

  标记的效率强烈依赖于浓度，并且在不同的蛋白质之间有所不同。因此，在每一种情况下，优化可能是必要的，以获得所需程度的标记。
• 缓冲成分

  
  

  含有伯胺(甚至微量)的蛋白质溶液会显著降低标记效率。确保你的蛋白质被充分透析，以防它与含胺物质接触。
• pH值的影响

  
  

  检查你的蛋白质溶液的pH值！参考范围是8.2 - 8.5。

  
  

  蛋白质的伯氨基不能被质子化而具有活性，因此，蛋白质溶液的pH值必须足够高。另一方面，NHS酯的水解速率随着溶液的pH值而增加，导致非活性染料。最佳标记结果在pH 8.3获得。

  
  

  在pH值较低的强缓冲蛋白质溶液中，100 mM碳酸氢钠可能不足以将pH值提高到最佳值。您可以添加更多的碳酸氢钠，直到达到最佳pH值。

注意，标记效率不仅取决于周围条件，还取决于蛋白质特性。蛋白质表面的三级结构和由此产生的赖氨酸数量以及等电点和蛋白质在pH 8.3下的行为起作用。

过度标注
过度标记的原因可能是蛋白质表面的大量赖氨酸和/或蛋白质在pH 8.3时的最佳特性。
为了防止过度标记，减少染料量或增加蛋白质浓度。你也可以减少反应时间。

缀合物的纯化
染料在水溶液中是不稳定的NHS酯的水解速率随着溶液的pH值而增加。因此，在每次标记反应中都会产生一定量的游离染料，需要从缀合物中分离出来。
如果纯化后的结合物仍然含有微量的游离染料，将其用于第二步纯化。通过SDS-PAGE检查结合物的纯度。
在游离染料浓度较高时，从缀合物中分离游离染料变得更加困难。浓度非常高时，色谱柱或膜甚至会被染料堵塞，因此应尽量优化标记反应，以降低游离染料的浓度。请记住，总收率受到额外纯化步骤的影响。

什么样的DOL是优的？
作为一个基本规则，每200个氨基酸一种染料是理想的，然而，最佳的标记程度取决于你的蛋白质以及你的预期应用。如果您不确定，请使用不同剂量的少量结合物检查您的分析，以获得最佳结果。
在任何情况下都要防止过度标记，因为这可能导致蛋白质聚集或相邻染料的荧光猝灭。

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