jenabioscience:Atto425 NT Labeling Kit 货号：PP-305L-425
Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一组科学家于1998年成立，利用超过25年的学术知识为100多个国家的研究和行业客户开发创新试剂。
供一般实验室使用。
运输:凝胶包装运输
储存条件:储存在-20°C
避免冷冻/解冻循环，避光储存
保质期:12个月
光谱特性: λexc436纳米，λ全身长的484纳米，ε 45.0毫摩尔-1厘米-1(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 7.5)
描述:
Atto425缺口翻译标记试剂盒包含缺口翻译标记所需的所有试剂(除了用于纯化探针的模板和材料),提供了一种高效、易于实施和快速的标记技术。
该试剂盒被推荐用于DNA的直接酶标记。Atto425 NT标记混合物包含经过特别优化的Atto425-dUTP，可通过DNA聚合酶I进行缺口翻译，从而整合到DNA中。荧光团出色的稳定性和量子产率，加上染料-dUTP复合物的高整合率，使其成为各种荧光应用的理想选择。
缺口翻译标记基于聚合酶I和脱氧核糖核酸酶I的反向活性。脱氧核糖核酸酶I能够在低酶浓度下将随机分布的缺口引入双链DNA。聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性从缺口的3’侧去除核苷酸，同时使用3’-OH末端作为引物合成部分新的互补链。在存在染料标记的dUTP聚合酶的情况下，I掺入标记的dUTP而不是dTTP。酶混合物中平衡良好的聚合酶/核酸酶活性确保了高度标记的双链DNA片段的产生。
所得DNA适用于FISH、微阵列基因表达谱和其他核酸杂交分析。
保护荧光标记的dUTP免受光照射，并在弱光条件下进行实验程序。
内容:
酶混合物(红色瓶盖)
储存缓冲液中的2单位/微升聚合酶I和0.02单位/微升脱氧核糖核酸酶I
NT标记缓冲液(绿色瓶盖)
10倍浓度
Atto425 NT标签混合物(紫色瓶盖)
0.5毫米dATP、0.5毫米dCTP、0.5毫米dGTP、0.25毫米dTTP、
0.25毫米Atto425-dUTP，pH 7.5
停止缓冲器(黄色盖子)
0.5 M EDTA，pH 8.0
PCR级水(白色瓶盖)
推荐的NT检测:
样品材料可以是超螺旋或线性化的质粒DNA、粘粒或BAC DNA、完整或部分染色体或纯化的PCR产物。
在无菌小瓶中制备以下反应混合物。
20 μl缺口翻译标记分析
| 填充至20微升 | PCR级水 | 白色帽子 |
| 2微升 | 10x NT标记缓冲液 | 绿色帽子 |
| 2微升 | Atto425 NT
标签混合 | 紫色帽子 |
| 1-1.5微克 | 模板dna | - |
| 2微升 | 酶混合物 | 红色帽子 |
- 轻轻涡旋混合物以确保均匀，并短暂离心以收集试管底部的反应混合物。
- 将试管置于15°c预冷的热混合器中。建议孵育90分钟，以产生大小在200和500 bp之间的DNA片段。
- 为了控制片段的长度，在琼脂糖凝胶上加载2 μl分析物。运行凝胶时，将反应管置于-20°C。
- 为了获得更小的片段，添加额外的2 μl酶混合物，并在15℃下延长孵育时间
- 为最终终止反应，添加5 μl终止缓冲液(黄色瓶盖)。进行纯化或储存在-20°c下
探针的纯化:
为了在反应混合物用于后续实验之前从反应混合物中除去未掺入的核苷酸，建议采用以下程序之一:
1.硅胶膜吸附纯化- PCR纯化试剂盒。不，第201页
Jena Bioscience PCR纯化试剂盒提供了一种简单有效的方法来纯化大于100 bp的DNA片段。该制剂基于二氧化硅膜技术，用于在高盐中结合DNA，并在低盐缓冲液中洗脱。请参考说明书。
2.异丙醇沉淀提纯
向反应混合物中加入1 μl糖原(2 mg/ml)、2 μl乙酸钠(3 M)和14 μl异丙醇，并轻轻充分混合。室温下孵育15分钟，并在4℃下以最大速度旋转30分钟。弃去上清液，用70 %乙醇洗涤2次(以最大速度旋转5分钟)。
3.离心过滤装置净化
未掺入的核苷酸可以用离心过滤装置通过离心去除。根据DNA片段的截止值选择过滤器装置，并遵循制造商的说明。
荧光团的掺入率:
DNA标记的效率可以通过计算掺入的荧光团与片段中碱基数量的比率(染料/碱基)来估计。
1.光密度的测量:测量标记的DNA片段在260 nm处的吸光度(A260)和激发最大值(λexc)为染料(A给…染色).
2.A的校正260阅读:为了获得核酸的精确吸光度测量，必须校正260 nm处染料的贡献。使用以下等式:
A基础= A260-(答给…染色x CF260)
Atto425的校正系数:CF260 = 0.27
3.标记率的计算:染料与碱的比例由下式给出:
染料/碱= (A给…染色x ε基础)/ (A基础x ε给…染色)
消光系数:
Atto425: ε给…染色= 45000厘米-1 M-1
dsDNA: ε基础= 6600厘米-1 M-1
ssDNA: ε基础= 8900厘米-1 M-1
寡核苷酸:ε碱基= 10000cm-1 M-1
实施例:染料与碱基之比为0.05对应于将10个dye-dUTP核苷酸分别掺入到含有200个核苷酸的DNA片段中，或者掺入到100 bp的PCR片段中。如果可以假设dATP、dCTP、dGTP和dTTP在DNA片段中的平均分布，50个现有dttp中的10个已经被dye-dUTP取代，导致20 %的标记率。
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