Thermo Scientific™ CloneJET™ PCR Cloning Kit是一个的阳性选择克隆系统，可以高效克隆各种PCR产物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段。该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。阳性选择载体和插入片段连接仅需5分钟即可获得超过99%的阳性重组克隆。PCR产物无需纯化。由具有校正活性的聚合酶(如：Pfu polymerase)扩增的平末端PCR产物可直接连入克隆载体。由无校正活性的聚合酶(如：Taq polymerase)或聚合酶混合物扩增的PCR产物在连接前需用试剂盒提供的热稳定DNA平端化酶削平突出末端(5分钟即可)。连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株。

试剂盒提供一个新颖的即用型阳性选择克隆载体pJET2.1/blunt。该载体含有致死的限制酶基因(内含多克隆位点)。多克隆位点插入外源片段会引起酶基因失活。因此只有转化了重组质粒的细菌才能存活形成克隆菌落。而自身环化的pJET1.2/blunt载体表达致死的限制酶(无外源片段插入)，转化后杀死大肠杆菌细胞。这种阳性筛选策略极大地加速了克隆筛选进程，节省了蓝白斑筛选的额外费用。

为方便酶切作图和插入片段基因操作，pJET1.2/blunt克隆载体的多克隆位点两侧各包含一个BglII识别序列。此外，该载体含有T7启动子，可用于体内或体外转录、插入片段测序等研究。

特点

• 快速 一 PCR克隆只需5分钟。
• 高效 一 >99%阳性克隆。
• 无克隆背景 一 阳性筛选载体。
• 通用一适合平末端和粘性末端克隆。
• 经济 一 无需昂贵的蓝白筛选。

应用

• 适用平末端和带有3'-dA尾的PCR产物克隆。
• 限制酶切割产物克隆。
• 测序克隆的DNA。
• 克隆插入片段体内和体外转录(T7启动子介导转录)。

质量控制

功能测试：含有3’-dA尾的对照PCR产物克隆证明重组子比率>99%。载体自连实验表明无克隆背景。pJET1.2 primers适合特异性高效测序。

组分

• pJET1.2/blunt Cloning Vector (pJET1.2 DNA sequence in txt format)
• T4 DNA Ligase
• 2X Reaction Buffer
• Blunting Enzyme
• pJET1.2 Forward Sequencing Primer
• pJET1.2 Reverse Sequencing Primer
• Control PCR Product (sequence of control PCR product in txt format)
• Water, nuclease-free
• 详细的操作手册

备注

电转化前，需用氯仿抽提使连接产物中的T4 DNA连接酶失活。