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ELISA试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板：一块（96孔）

2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1,600 pg/ml，将其稀释为400 pg/ml后，再做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别稀释成400 pg/ml，200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。如配制200 pg/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 400 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液：1×20ml。

4. 检测稀释液A：1×10ml。

5. 检测稀释液B：1×10ml。

6. 检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。

8. 底物溶液：1×10ml/瓶。

9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

11. 覆膜：5张

12. 使用说明书：1份

自备物品

1. 酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）

2. 微量加液器及吸头，EP管

3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸

标本的采集及保存

1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

4. 样本处理：血清或血浆标本*稀释5,000倍。

注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。

3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后立即进行检测。

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