化药制剂检测

疫苗专题：乳佐剂制备与理化结构特性

随着亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、抗*性抗体疫苗等各种新型疫苗的出现，免疫佐剂的研究越来越被人们关注，临床应用也越来越广泛。这些新型疫苗虽然具有抗原性良好、毒性低等优点，但因其免疫原性低，需要配合高效免疫佐剂的使用。免疫佐剂可以先于抗原或与抗原同时使用，能够非特异地增强机体对抗原的特异性免疫应答反应，而自己本身并无抗原性。对于很多传染病，因缺乏合适的佐剂而影响重组蛋白、多肽、菌苗、DNA疫苗、毒苗等的发展。因此，对于传染病的防控不仅是研发高效低毒的疫苗，免疫佐剂的研发也至关重要。

乳佐剂简述

油乳型佐剂是指将一定比例的油相和水相物料通过乳化，制备成油包水（W/O）或水包油（O/W）形式的乳剂。油乳型佐剂具有促进多种抗原产生高效价的抗体、使抗原连续刺激的时间相对延长、抗原接种的剂量减少、抗原接种的次数降低的优点。目前市场上常见的油乳佐剂主要有弗氏佐剂、白油 Span 佐剂、MF-59、ISA 206、ISA720、佐剂－65、SAF 等，其中人用疫苗多用水包油佐剂。

研究表明，粒径是影响纳米粒在体内运输和被抗原递呈细胞吞噬的重要因素。从细胞吞噬的角度来看，小于1μm的纳米粒子更容易被DC和巨噬细胞吞噬，粒径小于1μm适合引发系统免疫。从粒子传输的角度来看，小粒径的纳米粒(<100nm)更易通过淋巴管进行传输从而提高免疫效果，但是粒径过小纳米粒会滲入到血管中，过大又会影响其在淋巴管中的传输速度。因此粒径在20-50nm范围内的纳米粒是疫苗佐剂的佳粒径范围。但与此同时，目前上市和处于临床研究阶段的相应纳米级乳剂佐剂(如MF59、AS01-04系列、NB001-002系列等)，其粒径均大于160nm，使得纳米级(1-100nm) 药用制剂所具有的颗粒尺小、比表面积大、表面能高、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等优势无法充分发挥，同时上述佐剂亦不具有类似铝盐佐剂的良好蛋白抗原吸附能力，在一定程度上使疫苗的免疫保护效力及免疫持久性受到了限制。

纳米免疫佐剂中的纳米乳免疫佐剂，是一个由油、水、表面活性剂和助表面活性剂四部分组成、粒径为1~100nm、液滴多为球形，大小均匀，透明或半透明、具有热力学稳定性和各向同性、热压灭菌或高速离心稳定不分层、制备的条件温和、可自发形成的胶体分散系统。

纳米乳佐剂对疫苗具有以下显著优势：

(1)可抵抗体液的稀释和蛋白酶降解，从而保护抗原，增强药物吸收、提高抗原的生物利用率。

(2)促进疫苗的抗原摄取和递呈，提高药效。

(3)促进机体的免疫系统作用。

(4)提高药物的稳定性。

(5)工艺简单，易于制备与运输、容易保存。

因此，研制出粒径20-50nm范围、具有高度热力学稳定、且能刺激机体产生高强度的粘膜免疫应答纳米乳免疫佐剂对疫苗显得尤为重要。

制备方案

均质机的选择

微射流均质属于高压均质中的一种，在生物工程、轻工化工、食品饮料等领域均有广泛的应用。微射流均质的方法在作用过程中产生的一系列高强度破坏力（湍流力、剪切力以及空穴效应）能有效破碎较大颗粒的液滴，进而形成较小颗粒的纳米乳液，且均质条件、表面活性剂组分和浓度的变化都影响乳液粒径。Roberts等研究发现微射流均质机所具有空腔效应可以改变表面活性剂的结构，降低乳液的粒径大小，进而提高体系的稳定性，并适用于各类乳液。

由PSI专有技术研发的增压器及均质腔，通过调节恒定的均质压力并搭配优秀的Y、Z型几何结构微米级金刚石均质腔，能够获得稳定可控的剪切力，从而对工艺流程的稳定以及线性放大的保证起到可靠支持。高2069 bar的均质压力搭配低于100μm孔径的均质腔，其产出的高剪切力超过市面上绝大多数同类型仪器。低至15mL的死体积更利于用作实验研发、处理珍贵稀有样品。有助于研发、生产过程中优化配方以获得大的稳定性，延长货架期、降低生产成本。

PSI包括PSI-20、PSI-40、PSI-300等从小试到生产多种型号，可满足不同科研或生产需求。

理化表征：粒径和Zeta电位

CDE发布《病毒预防用疫苗研发技术指导原则（试行）》中指出“如涉及佐剂或新型抗原递呈系统，应结合其与抗原相互作用的结构或特性开展必要的质量研究，理化结构特性如佐剂等电点、粒径及其分布、与抗原的吸附率等；脂质体包封率、粒径等。”

（1）平均粒径和尾端大粒子：

粒径分布检测经典的表征手段，通过粒径分布可以直观分析出均质机制备后的差异。从而反推配方或工艺，指引研发。或者通过粒径检测来确认批间差，鉴定设备运行状况。

Nicomp Z3000采用DLS和PALS原理，通过对粒径分布（高斯分布和Nicomp多峰），PI值，Chi卡方值等作为质量控制指标。

稳定性研究一直是制剂里面重要的一项，引起不稳定的因素有很多，异常颗粒或者说尾端大颗粒往往受到忽视，虽然乳佐常规平均粒径一般在亚微米级别或者纳米级别，但是微米的乳粒往往大量存在，而这些尾端大颗粒的存在往往会吸附小颗粒，不断团聚成大颗粒，导致稳定性差，甚至出现破乳、油相分离等现象，影响产品质量。

AccuSizer A7000APS采用SPOS技术，可以实现针对500nm以上高浓度样品进行计数检测。通过对尾端大颗粒定量分析，轻松帮助客户找到之前一直困扰客户的质量问题。

（2）Zeta电位：

Zeta电位的检测往往通过纳米粒度仪进行检测，Zeta电位作为稳定性的一项参考指标。Zeta 电位是通过检测粒子与液体接触的扩散层电荷从而反映的是整个体系的稳定程度，一般受到PH值，温度，特殊添加剂（如表面活性剂）等因素影响，一般认为当绝对值大于30mv，体系较为稳定。

Nicomp Z3000采用ELS技术，通过频谱分析和PALS分析进行Zeta电位检测。无论是针对水相还是有机相样品，都可以轻松完成检测，更进一步通过Zeta电位正负值判定表面修饰，或通过pH调节来确定等电点IEP。

图四 某样品Zeta电位检测报告

总结

奥法美嘉通过PSI微射流均质机和PSS粒度仪的Nicomp Z3000、AccuSizer A7000APS提供从初乳均质到粒径分析的全套方案，为制药企业从研发到生产保驾护航。