化药新药研发检测

1    概述

1.1 药物代谢研究简介

药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有*的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。

药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较“干净”，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的*性。

由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组P450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。

1.2 药物代谢

药物代谢，又称药物的生物转化（biotransformation），是指药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程，是药物从体内消除的主要方式之一。药物在体内的生物转化，分为Ⅰ相代谢反应和Ⅱ相代谢反应。

肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢的各种酶。UGT家族是人体内仅次于CYP450家族的第2大药物代谢酶。UGT介导的葡萄糖醛酸结合代谢不仅会显著影响药物的口服生物利用度和药物的体内药动学过程，同时还与一些临床药物-药物相互作用、药物-草药相互作用、药物-食物相互作用，以及高胆红素血症、癌症、自身免疫性肝炎等多种疾病的发生发展密切相关。

UGT催化的葡萄糖醛酸化代谢反应是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）为葡萄糖醛酸的供体将一分子的葡萄糖醛酸转移到含有羟基、羧基、氨基、巯基以及酸性碳原子等基团的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的结合使这些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，进而更容易被排出体外。

1.3药物的Ⅱ相代谢

药物的Ⅱ相代谢，又称结合反应，是药物在Ⅱ相代谢反应中与一些内源性的物质（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）结合或经甲基化、乙酰化排出体外。药物的结合反应，常常使其转化为无活性的代谢物，且极性增加，以便药物排出体外。

药物的结合反应包括葡萄糖醛酸结合、硫酸化、乙酰化、甲基化、谷胱甘肽结合、氨基酸结合及缩合反应等。葡萄糖醛酸结合反应是体内生物转化最重要、最常见的结合反应。葡萄糖醛酸基的直接供体是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）（见图1）。

图1 葡萄糖醛酸结合反应

葡糖醛酸基转移酶（UGT）催化的葡萄糖醛酸化代谢反应是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）为葡萄糖醛酸的供体，将一分子的葡萄糖醛酸转移到含有羟基、羧基、氨基、巯基以及酸性碳原子等基团的脂溶性小分子底物上，葡萄糖醛酸和小分子底物的结合使这些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，进而更容易被排出体外。

例（图2）：

图2α-D-UDP-葡糖醛酸和异源物的结合反应

例（图3）：

图3 苯甲酸的葡萄糖醛酸结合反应

一般来说，药物先进行Ⅰ相反应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动Ⅱ相反应，但有些药物可直接进行Ⅱ相反应。

2    实验原理

Ⅱ相代谢，又称结合反应，指Ⅰ相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子发生结合，使药物毒性、活性降低或极性增加而易于排出的反应。在药物的Ⅱ相代谢中，与葡萄糖醛酸的结合反应最为常见，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）进行反应，形成葡萄糖苷酸，使其水溶性增加，易于排出体外。因此，在体外，如若加入肝微粒体和UGT系统，便可重建Ⅱ相代谢体系，从而进行Ⅱ相代谢稳定性研究。

3    肝微粒体体外温孵法实验方法描述

肝微粒体体外温孵法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用HPLC、HPLC-MC和LC-MC/MC等测定温孵液中原型药物剩余含量或其代谢产物生成量的方法。

3.1 肝微粒体制备

微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图4）：

图4 肝微粒体制备流程图

3.2 体外孵育体系的建立

Ⅱ相代谢稳定性研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。

推荐的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µL，体系包括0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液，NADPH发生系统（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM的氯化镁），UGT孵育系统（5 mM UDPGA，5 mM D-葡萄糖二酸-1.4-内酯，50μg/mg蛋白的丙甲菌素），0.1 mg/mL~1 mg/mL肝微粒体蛋白，合适浓度的待测物，于37°C水浴孵育，每个样品平行3次，将待测物换为7-羟基香斗素，作为阳性对照， 阴性对照组分三组：a.只加UDPGA；b.只加A液、B液；c.不加UDPGA、A液、B液。于预设的反应时间点，如0，5，10，15，30，60 min后加入等体积预冷的乙腈终止反应。

3.3 药物代谢的检测

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采用HPLC、HPLC-MC和LC-MC/MC测定温孵液中原型药物的剩余含量或其代谢产物。

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