饲料检测

    氨基酸是动物的生长发育及动物体内营养物质的正常代谢所必须的重要组分，因此是评价饲料营养成分的一类重要指标，准确检测氨基酸的含量和种类对于饲料质量评价和控制具有重要意义。本文采用柱前衍生法，可同时对饲料中的17种氨基酸进行分析测定。

一、实验部分

1.1 仪器与试剂

LC1620A高效液相色谱仪（含UV检测器1台，P1620A高压恒流泵2台，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）

FA2004电子分析天平

恒温箱

水解管（5型）

旋涡混匀器

氢氧火焰机

乙腈(色谱纯，沃凯)

氨基酸标准品溶液（上海月旭）

超纯水

2，4-二硝基氟苯（DNFB）、N,N-二甲基酰胺、浓盐酸、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、冰醋酸（均为分析纯）。

1.2 标准品溶液配制

1）氨基酸标准品溶液：氨基酸标准品溶液用水稀释10倍到所需浓度（见表1）。

2）衍生化缓冲液的配制：称取21g的NaHCO₃于1L烧杯中，加水470mL，摇匀、溶解。过滤至500mL试剂瓶中，再加乙腈30mL，摇匀即得。

3）衍生化试剂：取1mL DNFB加入100mL定量瓶中，乙腈定容至刻度即得。

4）平衡溶液的配制 ：取KH₂PO₄ 3.4g，加0.1mol/L的NaOH溶液145.5mL，加水至500mL，摇匀，过滤，贮存置棕色瓶中即得。

5）6mol/L盐酸：取浓盐酸500mL加入1L烧杯中，再加水500mL，摇匀即得。

1 十七种氨基酸浓度表

1.3 色谱条件：

色谱柱：Welch unitary Amino acid柱（4.6×250mm，5um）

流动相：A：40mM乙酸钠缓冲液（冰醋酸调pH调至6.5）（含10mM N,N-二甲基酰胺）B：乙腈：水=1：1，梯度洗脱（见表2）

流速：1.2mL/min

柱温：28℃

波长：360nm

进样量：10ul

表2 梯度程序表

1.4 样品前处理（氨基酸衍生化方法）

1. 精确称取研磨成细粉的样本粉末200mg置于水解管中，加入6mol/L的盐酸12mL，轻微震荡。用氢氧火焰机融化水解管颈部*密封。
2. 放于烘箱中145℃水解4小时，冷却至室温；
3. 小心敲碎水解管顶部；把水解液及残渣用漏斗和滤纸过滤，滤至50mL容量瓶中；再用水洗涤水解管，每次洗涤水均再次洗涤滤纸，反复6-7次，然后加水定容至容量瓶刻度；
4. 用微量注射器取10ul定量好的溶液至1mL玻璃细管中，真空抽干（去HCl），然后依次加入衍生化缓冲液和衍生化试剂各20ul，涡旋30s，用多层密封带封口；
5. 置烘箱中64℃衍生化30min，冷却至室温；
6. 加平衡缓冲液160ul，混匀30s，经0.45um滤膜过滤，作为待测样品溶液。

实验结果请参见文档