化药新药研发检测

一、引言

含有二硫键的环肽代表了一类具有广泛生物功能的化合物，其功能范围从毒素到重要的激素。¹二硫键有助于稳定肽的二级结构和构象，这有利于提高蛋白水解稳定性和目标亲和力。²由于它们具有潜在的治疗价值，对合成含二硫键桥连的环肽的兴趣稳步增长。通过使用正交保护的半胱氨酸氨基酸，如Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH（图1），可以制备含有二硫键的肽。Cys(Mmt)基团可以使用稀释的三氟乙酉夋(TFA)溶液选择性去保护，而Cys(STmp)基团则使用二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂进行正交去保护。去保护后，使用N-氯琥珀酰亚胺(NCS)作为温和氧化剂，可以选择性氧化Cys巯基形成二硫键。³

在这里，我们报告了使用Liberty Blue^TM微波肽合成器全自动合成良好纯度的含二硫键桥连的环肽。一个骨形态发生蛋白受体激活素样激酶3 (Alk3)的肽激动剂THR-123⁴，在3小时内完成合成，纯度为77%。最后，一种含有两个二硫键的锥蜗牛毒素肽（Conotoxin-SI）⁵在不到4小时内合成，纯度为67%。将微波能量应用于二硫键桥连肽的合成可以实现更高效的偶联，从而快速合成并达到高纯度（CarboMAX^TM）。⁶

图1. 左：Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH；右：Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH

二、实验部分

HE-SPPS材料和方法：所有肽都是在CEM Liberty Blue™自动微波肽合成器上合成的，使用的是Rink Amide ProTide™ LL树脂（0.19 mmol/g替换）或Cl-MPA ProTide™ LL树脂（0.18 mmol/g替换）。使用DMF进行后去保护洗涤，然后采用DIC/Oxyma活化方法进行偶联。肽树脂在CEM Razor^®肽裂解系统上用TFA/TIS/H₂O/DODT（92.5/2.5/2.5/2.5）裂解。肽在冷乙酉迷中沉淀，粗品在分析前进行冻干。

分析：粗肽在配备了Acquity UPLC BEH C8柱（1.7 μm, 2.1 x 100 mm）的Waters Acquity UPLC系统上进行分析，该系统装有PDA检测器。UPLC系统连接到Waters 2100单四级杆MS用于结构测定。峰分析是在Waters MassLynx软件上完成的。分离是通过（i）水中的0.05% TFA和（ii）乙腈中0.05% TFA的梯度洗脱进行的。

三、结果和讨论

A）合成THR-123，CYFDDSSNVLCKKYRS-CO₂H

选择THR-123（图2）来展示含有C端酸的单一二硫键桥连肽的合成。该肽在10 µmol规模上使用Cl-MPA ProTide™ LL树脂（0.18 mmol/g替换）进行合成。第一个氨基酸使用CEM之前报道的氯化物加载循环自动加载。所有其他氨基酸循环使用1分钟/90ºC去保护和一次2分钟/90ºC与DIC/Oxyma偶联（使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C）。使用2% TFA的DCM溶液进行Cys(Mmt)的去保护。反应在室温下进行1分钟，重复五次。使用25 mM的NCS的DMF溶液实现二硫键的形成。反应在室温下进行15分钟。在Liberty Blue自动微波肽合成器上进行的THR-123的微波增强SPPS产生了77%纯度的目标肽（图3）。

图2.THR-123

图3. THR-123的UPLC色谱图

B) 合成Conotoxin-SI，ICCNPACGPKYSC-NH₂

选择Conotoxin-SI（图4）来展示含有两个二硫键的环肽的合成。该肽在10 µmol规模上使用Rink Amide ProTide™ LL树脂（0.19 mmol/g替换）进行合成。所有氨基酸循环使用1分钟/90ºC去保护和一次2分钟/90ºC与DIC/Oxyma偶联（使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C；使用Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH用于C）。使用2% TFA的DCM溶液进行Cys(Mmt)的去保护。反应在室温下进行1分钟，重复五次。使用25 mM的NCS的DMF溶液实现二硫键的形成。反应在室温下进行15分钟。使用5% DTT + 0.1 M NMM的DMF溶液进行Cys(STmp)的去保护。反应在室温下进行5分钟，重复三次。最后，使用25 mM NCS的DMF溶液形成第二个二硫键（室温下15分钟）。在Liberty Blue自动微波肽合成器上进行的Conotoxin-SI的微波增强SPPS产生了67%纯度的目标肽（图5）。

图4.Conotoxin-S

图5. Conotoxin-SI的UPLC色谱图

四、结论

采用全自动快速合成技术，我们成功高效地完成了含二硫键桥接的环肽的合成，并且实现了较高的纯度。借助CarboMAX™⁶化学技术，偶联效率得到了显著提升，这不仅极大缩短了合成时间，还确保了产物的高纯度。例如，一个C端带有羧酸的环状二硫键桥接肽——THR-123，在短短不到3小时的时间内就被迅速合成出来，且纯度达到了77%。相比之下，传统的室温合成方法通常需要长达20小时来合成包含两个二硫键的Conotoxin-SI。³而利用微波增强的固相肽合成技术（SPPS），在不到4小时内就制备出了纯度为67%的相应肽。

引用

1 Góngora-Benítez, M.; Tulla-Puche, J.; Albericio, F. Chem. Rev. 2014, 114 (2), 901–926.

2 Adessi, C.; Soto, C. Curr. Med. Chem. 2002, 9 (9), 963–978.

3 Postma, T. M.; Albericio, F. Org. Lett. 2013, 15 (3), 616–619.

4 Sugimoto, H.; LeBleu, V. S.; Bosukonda, D.; Keck, P.; Taduri, G.; Bechtel, W.; Okada, H.; Carlson, W.; Bey, P.; Rusckowski, M.; Tampe, B.; Tampe, D.; Kanasaki, K.; Zeisberg, M.; Kalluri, R.; Kalluri, R. Nat. Med. 2012, 18 (3), 396–404.

5 Azam, L.; McIntosh, J. M. Acta Pharmacol. Sin. 2009, 30 (6), 771–783.

6 CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”