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N-亚硝胺类杂质是一类分子中含有N-亚硝基结构的化合物，它们常以痕量浓度存在于食品、烟草、消毒后的饮用水及塑胶制品中，在药物的生产和制剂制备过程也会不可避免地会产生或者引入N-亚硝胺类杂质。多种Ｎ-亚硝胺类杂质具有遗传毒性风险，可造成DNA损伤，进而诱发癌症。因此，需要对含有Ｎ-亚硝胺类杂质的化合物进行遗传毒性检测，评估其致突变性和致癌性风险。

N-亚硝胺类杂质

N-亚硝胺类化合物（N-nitrosamines，NAs）是一类含有亚硝基官能团，结构通式为 R1（R2）N-N=O的化合物。其生成机制多样，包括仲胺类化合物与亚硝酸之间的相互作用，叔胺类化合物与一氯胺之间的亲核取代反应，溶剂N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的氧化，橡胶硫化剂与空气中氮氧化合物相互作用等。

N-亚硝胺类化合物在自然界和食品中广泛存在，如室外空气、水、土壤、熏肉、烤肉、酒精-饮料、谷物、奶制品、鱼类、水果和蔬菜，但含量较少。在药物的生产和制剂制备过程也会不可避免地会产生或者引入N-亚硝胺类杂质。多种NAs具有遗传毒性风险，即化合物存在DNA反应活性，可造成无法修复的DNA损伤，甚至碱基突变，并可进而引发癌症。遗传毒性风险通常与剂量无关，存在遗传毒性的化合物可以在极低剂量水平下导致人体DNA损伤，且该损伤效应可通过遗传物质的复制而不断放大。

国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）目前已批准把十余种N-亚硝胺类化合物列入致癌物清单，其中N-亚-硝基二-甲胺（N-dimethylnitrosamine，NDMA）和N-亚硝基二乙胺（N-diethylnitrosamine，NDEA）被归类为对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分的2A类致癌物；还有数种N-亚硝胺类化合物被归类为对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分的2B类致癌物。此外，人用药品注册技术要求国际协调会（International Coucil for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质的 ICH M7指导原则将致癌风险高的NAs列为“关注队列”，并基于已知的致癌和致突变数据，将其归为“具有已知致癌致突变性”的Ⅰ类杂质，需要得到最为严格的控制。

N-亚硝胺类杂质（N-nitrosamines）产生强烈致癌性的遗传毒性的物质基础并非原型物质，而是其代谢产物。在诸多N-亚硝胺类化合物致癌机制中，当前最-广为接受的是ɑ-羟基化假说，即Ｎ⁃亚硝胺ɑ-碳上的氢经多种氧化酶和氧合酶（如细胞色素酶P450 CYP2E1和CYP2A6等）羟基化后可形成致癌物。Ｎ⁃亚硝胺首先被羟化酶激活生成α⁃羟基化亚硝胺，这是一种不稳定且具有诱变性的中间体，可自发分解成甲醛和甲基重氮羟化物。甲醛可以依次氧化生成甲酸和二氧化碳，甲基重氮羟化物可以分解成烷基重氮离子，它可以与DNA碱基对反应，使DNA碱基烷基化生成烷基鸟嘌呤并诱发致癌反应。以NDMA为例，其具体致癌机理如图１所示。

图1 NDMA的致癌机理（来源：药品中N-亚硝胺类有害杂质）

并非所有N-亚硝胺类化合物均存在致突变性。随着对药品中亚硝胺类杂质控制的重视，明确某个亚硝胺类化合物是否具有致突变性是界定其监管限度的关键，因此，需要对含有Ｎ-亚硝胺类杂质的化合物进行遗传毒性检测，评估其致突变性和致癌性风险。

关于N-亚硝胺类杂质遗传毒性检测的增强Ames试验

Ames试验，又称细菌回复突变试验（Bacterial Reverse Mutation Test)，于1975年建立并不断发展完善，至今已成为国际上通用的遗传毒理评价体系的必检项目，同时也是许多遗传毒理学新兴技术发展过程中对照验证结果的试验之一，广泛应用于化合物的致突变性和潜在致癌性的初筛检验。

EMA最新发布的“Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal product（EMA Q&As指南）”中提到，对N-亚硝胺而言，由于某些N-亚硝胺（如NDMA）在标准Ames试验的条件下灵敏度低，因此建议采用FDA国家毒理学研究中心提供的增强Ames试验（Enhanced Ames Test）的测定条件。因为FDA认为，用于Ames测试的标准方法可能不足以表征N-亚硝胺的致突变潜力，在某些情况下会产生已知致突变亚硝胺的阴性结果。对此，FDA国家毒理学研究中心一直在测试不同的条件，以开发增强Ames测试（Enhanced Ames Test），旨在对N-亚硝胺杂质潜在致突变性提供更可靠的评估。

以下为FDA提供的增强Ames试验（Enhanced Ames Test）条件：

需要指出的是，如果在标准的Ames试验中产生了阳性结果，则没有必要使用增强的Ames试验条件进行额外的试验。 如果标准Ames试验是阴性结果，则需要进行增强Ames试验检测。如果结果为阴性，还应进行体内致突变性试验，因为专家成员一致认为，单一的体外突变试验不足以评估N-亚硝胺化合物的致癌性。如果体内致突变试验结果也是阴性，则必须进行专家知识和全面评估。在得出N-亚硝胺类化合物的非致突变性结论之前，应彻-底评估其致突变性，因此一些N-亚硝胺类杂质是非致突变但致癌的，这一点必须要引起足够重视。

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正如前文中提到的，N-亚硝胺类杂质（N-nitrosamines）产生致癌性的遗传毒性的物质基础是其代谢产物，结合EMA 关于亚硝胺杂质问答文件中提到的“增强Ames试验需要使用大鼠肝S9和仓鼠肝S9（Hamster Liver S9）作为代谢活化系统”，IPHASE作为体外研究生物试剂引-领者，凭借先进的设备，专业的技术人员和多年研发的经验，继成功研发诱导SD大鼠肝S9后，又成功开发出国内-首-家诱导仓鼠（金黄地鼠）肝S9（Hamster Liver S9）。IPHASE诱导仓鼠（金黄地鼠）肝S9是使用苯-巴比-妥钠和β-萘黄酮联合诱导仓鼠（金黄地鼠）的肝脏制备而成，经过了无菌检查、代谢活性检测，并以Ames和染色体畸变试验进行质控，结果显示诱导仓鼠（金黄地鼠）肝S9与诱导SD大鼠肝S9试验结果接近，说明仓鼠（金黄地鼠）肝S9符合标准，可满足体外遗传毒理试验需求。

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参考资料：

[1] Questions and Answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products.EMA,2024.

[2] 曹梦茹，叶志伟，汪隽，等. 药品中N-亚硝胺类有害杂质[J]. 化学进展，2023, 35(12): 1881-1894.

[3] 叶倩，耿兴超，张河战，等. 亚硝胺类遗传毒性杂质的监管策略及思考[J]. 中国药事，2021, 35(2): 127-137.

[4] 叶倩，汪褀，文海若. 不同代谢活化条件对 N-亚硝胺类化合物细菌回复突变结果的影响[J]. 中国医药生物技术，2022, 17(2): 118-124.

[5] 于颖洁. 药物中N-亚硝胺类杂质的检测方法研究[D]. 中国食品药品检定研究院. 2021.

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