化药制剂检测

一、摘要

美国食品药品监督管理局（FDA）建议在进行阿昔洛韦霜的体外渗透测试（IVPT）时，在每次取样间隔进行完荃介质更换，原因是存在“明显的负向通量”。完荃更换需要大量的分析干预或复杂的自动化操作，并且通常需要使用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）来检测如此低的浓度，所有这些都可能既昂贵又复杂。选择使用等分取样法进行IVPT可能更简单，并允许使用成本较低的液相色谱（LC）设备，因为在研究期间，分析物的浓度足够高，可以使用高效液相色谱紫外检测（HPLC UV detection）进行准确定量，同时在整个延长的运行过程中保持溶解度漏斗条件。这项研究显示，在使用现代扩散装置进行阿昔洛韦霜的IVPT时，等分取样是合适的，这可能是由于扩散池设计的创新确保了接收室和臂干的均一性，消除了“明显的负向通量”，这是业界一直无法解释的现象。尽管本研究使用的是阿昔洛韦作为测试成分，但部分介质更换也可以用于其他化合物，如类固醇或抗真菌化合物。

二、引言

在美国，许多药品的通用版本广泛可用，这对经济和社会产生了深远的影响。¹ 通用药品的经济可负担性直接源于开发大多数通用药品时采用的高效科学和监管方法，这通常依赖于比较药代动力学（PK）研究来评估药物在作用部位或附近的释放速率和程度是否与参考上市药品（RLD）一致。²

这种方法用于评估比较生物利用度（BA）是最准确、最敏感且蕞具可重复性的方法之一，以证明通用药品的生物等效性（BE）。对于旨在输送到全身循环的药物，如许多口服剂型一样，这种方法涉及在给药后的多个时间点采集血液样本，并测量血浆或血清中的药物（或相关分析物）浓度，这是一个相对简单的过程。然而，对于局部作用药物，如局部皮肤用药产品，评估药物在皮肤作用部位或附近的浓度更具挑战性。因此，通用版局部用药的开发通常依赖于比较临床终点BE研究，这些研究不如PK研究准确、敏感和可重复，且成本更高、耗时更长。大多数通用局部用药产品被归入昂贵且低效的开发路径，因此成为通用药品开发商进入市场的障碍，并对它们的可获得性和经济性产生了负面影响。

局部皮肤用药产品中显著的例外是含有糖皮质激素的药物，美国食品和药物管理局推荐使用更高效的体内药效学（PD）血管收缩试验来证明其BE。因此，尽管这些含糖皮质激素的乳膏、软膏和其他局部剂型只占局部皮肤用药产品的一小部分，但这些RLD产品有多个通用版本可供选择。本研究的假设是，如果可以开发出同样高效的皮肤PK、BE方法，这些方法可以促进更多经济实惠的通用局部皮肤用药产品的可用性。

近几十年来，已经考虑了现有体外和体内皮肤PK方法的可行性，每种方法都有不同的优势和局限性。在这些方法中，最有前景的是体外渗透试验（IVPT）方法，该方法已显示出与体内结果的良好相关性。值得注意的是，IVPT研究特别显示出与体内评估BE的相关性，并具有预测性。

本工作的目标是评估一种用于阿昔洛韦霜BA的IVPT方法，完荃更换接收液³与部分更换接收液相比。

该研究由一位经验丰富的教授监督，在孟买Chembur East的Vivekanand教育协会药学院（VES Pharmacy）由一名训练有素的研究员进行。Hanson的Phoenix DB-6系统已安装，并在研究开始前由位于印度孟买的Teledyne Hanson服务工程师进行了IQ、OQ、PQ验证。

三、材料和方法

材料：本研究使用了以下试剂和材料。

以下仪器在本研究中使用：

皮肤：皮肤样本取自印度马哈拉施特拉邦Navi Mumbai的国家烧伤中心。

皮肤准备：皮肤采集程序：

第一阶段：使用取皮刀获取皮肤，并储存在含有抗生素的50%甘油中。

第二阶段：将每条皮肤从50%甘油转移到含有抗生素的85%甘油中。

第三阶段：第二阶段后（21天），皮肤在4-8°C下储存在85%甘油中。

分析当天，皮肤被解冻、清洗并用PBS溶液（接收介质）冲洗，根据所需数量使用模具和冲孔机（Neiko 0261 14A重型工具01594L，Duty空心孔冲孔套装）切成25毫米的圆形片段；每片皮肤都在放大镜下进行视觉检查，以确认是否有任何损伤或不适合使用的情况，作为完整性确认的一部分。此外，使用校准的微螺旋测微器测量每个皮肤部分的厚度。厚度测量完成后，将皮肤安装在12毫升Franz扩散池的供体隔室中。

体外渗透试验

使用Teledyne Hanson扩散系统（手动系统，Phoenix DB-6）进行IVPT实验。使用了12毫升的扩散池，其渗透面积为1.0平方厘米。接收液是含有0.1%叠氮钠的PBS缓冲液（pH 7.4），搅拌速度为400转/分钟。皮肤样本安装在扩散池中，表皮面向供体隔室（n = 3）。使用正位移移液器将单剂量26.55毫克/平方厘米的阿昔洛韦霜（每平方厘米1.37毫克阿昔洛韦）涂在皮肤表面。在皮肤表面涂抹霜剂后，用正位移移液器的暴露聚四氟乙烯尖立耑轻轻将制剂涂抹在整个渗透区域。剂量应用区域在整个实验过程中保持开放，不进行任何封闭。IVPT实验持续72小时，连续采样时间点。选择两个参数，Jmax和与阿昔洛韦渗透曲线的AUC相对应的累计总渗透量作为两个关键参数。所得的接收液样品通过高效液相色谱（HPLC）进行分析。

四、HPLC样品分析

IVPT样品在由Jasco 4000系列组成的HPLC系统上进行分析，配备PDA检测器和ChromNav数据采集软件，版本1。使用部分验证的HPLC方法对IVPT样品进行定量测定。采用BakerBond 5μC18（250 x 4.6 mm）柱来洗脱阿昔洛韦。流动相为甲醇与50 mM磷酸钠溶液按5:95（体积比）混合，用磷酸调节pH至6.0。流速为1.0 mL/分钟。阿昔洛韦峰在254 nm处检测。IVPT样品的进样量为100 µL。IVPT扩散样品的定量下限（LLOQ）为0.025 μg/mL。

五、体外渗透试验（IVPT）结果

当使用从两名供体获得的皮肤进行IVPT测试实验，筛选和比较阿昔洛韦霜时，通过Zovirax霜中阿昔洛韦的皮肤渗透量采用两种不同的取样技术进行测量：（i）部分样品取出和（ii）完荃样品取出。

图1和图2展示了每个时间间隔使用部分取样的IVPT数据。观察到供体内部变异性，但供体内变异性仅为完荃替换对照的三分之一（%RSD < 5.0）。两个供体的总体结果表明，阿昔洛韦霜的AUC（0-72小时）分别为102 µg/cm²和64.4 µg/cm²。阿昔洛韦霜的Jmax分别为2.8 µg/cm²/h和3.9 µg/cm²/h。Tmax为两个供体均为24小时。在完荃替换中可能会存在高变异性，因为每次取样点的药物浓度非常低，这导致许多分析接近定量下限（LLOD）。然而，部分替换稳定允许接收液中的活性药物浓度增加，使用HPLC系统作为分析技术提供了更好的结果，因为分析仪器在检测范围内运行，使得结果更加一致。

图1：阿昔洛韦的累积渗透（部分替换）

图2：阿昔洛韦的渗透曲线（部分替换）

图3和图4展示了每个时间间隔使用完荃介质替换取样的IVPT数据。观察到供体内变异性，但供体内变异性非常低（% RSD < 15.0）。两个供体的总体结果表明，阿昔洛韦霜的AUC（0-72小时）分别为10.9 µg/cm²和4.8 µg/cm²。阿昔洛韦霜的Jmax分别为0.4 µg/cm²/h和0.12 µg/cm²/h。Tmax为两个供体均为72小时。

图3：阿昔洛韦的累积渗透（完荃替换）

图4：阿昔洛韦的渗透曲线（完荃替换）

结果 - 总结表1

六、结论

这些结果表明，IVPT研究可以使用两种取样程序进行。从数据中可以看出，使用部分体积替换产生的变异性小于完荃替换。完荃替换方法观察到的滞后时间长达24小时，而部分替换研究的滞后时间仅为4小时。这24小时的滞后时间是由于完荃替换导致的，因此阿昔洛韦的浓度低于HPLC分析的定量下限（LLOQ）。在部分替换研究中，观察到的Jmax值较高，因为在整个研究期间活性成分的浓度逐渐增加，而在完荃替换的情况下，观察到的Jmax值非常低。因此，建议在使用完荃替换取样程序时使用LC-MS进行定量测定。LC-MS是一种昂贵且需要特殊环境条件进行日常维护的仪器，任何组织都难以承担其使用和维护成本。因此，我们建议在进行IVPT研究时，使用部分替换方法，即在每个时间点取样时不进行接收介质的完荃替换，而是采用等分试样取样程序，特别是当使用HPLC分析时。

七、引用

1. In Vitro Skin Permeation Methodology for over-the counter Topical Dermatologic Products

2. Evaluating Bioequivalence with an In Vitro Permeation Test and an Adaptation of Scaled Average Bioequivalence

3. Draft Guidance on Acyclovir, Recommended Dec 2014,Revised Dec 2016