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抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是近年来肿瘤靶向治疗领域发展最快的药物类别之一。连接子(Linker)连接着细胞毒性药物和抗体，是ADC药物的关键部件之一。ADC中的连接子可分为可裂解和不可裂解两种形式，目前的ADC研究主要集中在可裂解连接子上。而在可裂解连接子中，组织蛋白酶可裂解连接子是目前应用最-广泛以及研究最深入的，其中组织蛋白酶B发挥着至关重要的“切割”作用。

ADC药物简介

抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）由靶向肿瘤特异性抗原或者靶向肿瘤相关抗原的单克隆抗体(Antibody)，与不同数目的小分子细胞毒素(Payload)通过连接子(Linker)偶联而成（图1），兼具传统小分子药物的杀伤效应和抗体药物的靶向性，已成为肿瘤靶向治疗的重要药物之一。ADC药物的核心作用机制是在胞内释放出活性细胞毒素(Payload)，干扰关键细胞机制，从而杀死靶细胞。因此，Payload的释放机制是ADC药物研发的关键点。

图1 ADC药物的结构和功能示意图（来源：Antibody drug conjugate: the“biological missile” for targeted cancer therapy）

Payload的释放机制因连接子类型而异。ADC中的连接子可分为可裂解和不可裂解两种形式。可裂解连接子主要为敏感性的化学键，可以根据体内环境的特异性化学物种（如谷胱甘肽、酸碱性等）或酶浓度不同，促进连接子与药物裂解，主要通过腙键、二硫键、多肽的形式连接。不可裂解连接子没有可触发裂解的内置化学键，需要在癌细胞的溶酶体中将抗体通过蛋白质水解机制变成氨基酸，进而释放带有连接子和氨基酸片段的细胞毒性药物，主要通过硫醚的形式连接。

【可裂解连接子】

腙键特点：对pH值敏感。在血液环境（pH 7.35-7.45）稳定，而在酸性细胞区室，例如溶酶体(pH 4.5-5.0)中会被水解释放Payload; 腙键连接子在血液循环过程中并不稳定，易造成脱靶效应，目前其应用主要局限于血液瘤。

二硫键特点：可被谷胱甘肽(GSH)还原裂解。胞外体液环境中谷胱甘肽的浓度为2-20μmo/L，远低于细胞质中谷胱甘肽的浓度(1-10 mmol/L)，而肿瘤细胞中GSH浓度会更高，从而还原切割二硫键，促进Payload的释放。因此，二硫键连接子在循环系统中相对稳定，并具有一定肿瘤特异性。

糖苷键特点：可被β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶切割。含有β-葡萄糖醛酸的连接子具有很高的亲水性，可减少ADC的聚集，同时具有很好的稳定性。

肽键特点：可被组织蛋白酶B切割，这是一种溶酶体蛋白酶，在肿瘤细胞中过度表达，而在血液中存在蛋白酶抑制剂。因此，这种连接子在循环系统中高度稳定，而进入肿瘤细胞后会被溶酶体组织蛋白酶B切割，从而实现细胞毒性药物在癌细胞中靶向释放的功能。

【不可裂解连接子】

硫醚键特点：该类型连接子ADC的药效发挥依赖于内吞机制，经肿瘤细胞内吞后进入溶酶体，ADC的抗体部分被降解，释放出包含细胞毒素、linker和氨基酸残基的复合物。这种连接子在血液环境中更加稳定，但带电荷的氨基酸残基会影响细胞毒素的细胞穿透膜能力，导致其不能发挥效“旁观者效应”。

目前，组织蛋白酶B可裂解连接子是应用最-广泛以及研究最深入的，同时也是目前唯-一有实际应用于上市ADC药物的酶裂解型连接子。目前全球已上市的ADC药物达15款，其中有8款是组织蛋白酶B可裂解的Linker（表1）。下面，让我们一起来揭开具有强大“切割”力量的组织蛋白酶B的神秘面纱。

表1  全球已上市的ADC药物一览

组织蛋白酶B：背后蕴藏的“切割”力量

组织蛋白酶B（Cathepsin B）是一种半胱氨酸组织蛋白酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族，是一种胞内酶，主要分布于细胞溶酶体中。在病变情况下，也会分泌到细胞膜外周微环境或者胞外。组织蛋白酶B由一个重链和一个轻链组成的二聚体，具有羧基肽酶和内肽酶活性。羧基肽酶活性使得组织蛋白酶B可选择性识别某些氨基酸序列以切割序列 C 端侧的肽键接头，例如缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）、缬氨酸-丙氨酸（Val-Ala）和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（GGFG）等。这些Linker在已获批的ADC中广泛应用，具体裂解过程如图2所示。内肽酶活性则使组织蛋白酶B参与细胞外基质的降解，从而涉及肿瘤的侵袭和转移。

图2 组织蛋白酶B催化肽键连接子的裂解过程示意图（来源：抗体偶联药物连接技术的研究进展）

由于组织蛋白酶B在多种肿瘤细胞中过表达，如乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、甲状腺癌等，并且是一种特异性的胞内酶，因此是现在ADC药物研发主要考虑的Linker裂解酶，可以实现特异性和高效的胞内切割。另外，其他处于早期研究的Linker裂解酶还有组织蛋白酶M、组织蛋白酶L、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、硫酸酯酶、磷酸酶和天冬酰胺内肽酶（莱古酶）等。

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IPHASE技术人员通过测定底物Z-RR-AMC的代谢减少速率来评估组织蛋白酶B的活性。孵育体系中组织蛋白酶B终浓度为2μg/ml，底物Z-RR-AMC终浓度为1μM，孵育时间为60min，最终测得组织蛋白酶B的活性为8000pmol/min/mg。

除了组织蛋白酶B（Cathepsin B）外，针对ADC药物中payload其他释放形式、代谢稳定性、血浆蛋白结合等方向的研究，IPHASE推出了肝溶酶体、肝S9、酸化肝匀浆液，肝微粒体及空白血浆等产品，全面助力客户ADC药物开发研究！

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参考资料：

[1] Zhiwen Fu, Shijun Li, Sifei Han, et al. Antibody drug conjugate: the“biological missile” for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy.2022,7(1):93

[2] 李云峰，辛杰，李静，等. 抗体偶联药物连接技术的研究进展[J]．中国新药与临床杂志，2022, 41(12): 719-728.

[3] Mckertish, C.M.; Kayser, V. Advances and Limitations of Antibody Drug Conjugates for Cancer. Biomedicines 2021, 9, 872.

[4] Baah, S.; Laws, M.; Rahman, K.M. Antibody–Drug Conjugates—A Tutorial Review. Molecules. 2021, 26, 2943.

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[6] Zheng Su, Dian Xiao, Fei Xie, et al., Antibody-drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharm Sin B. 2021.11(12): 3889-3907.

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