核苷由碱基及核糖构成，是生物体内用于合成遗传物质（DNA和RNA）的重要原料！除8种常见核苷外，还存在多种天然修饰核苷以及经过结构优化的化学合成的修饰核苷。修饰核苷主要用作各类核苷类药物（抗癌药物等）的研发以及作为合成小核酸药物的原料等。

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随着瑞德西韦被FDA批准为治疗的药物，核苷类药物以及相关衍生药物再次受到医学界的广泛关注，它是临床上用于治疗病毒感染性疾病、肿瘤、艾滋病等的一类重要的药物。

在药物研发的进程中，为了提升核苷类分子的药动学和药效学性质，常针对核苷的碱基、糖苷键、糖环等进行修饰，从而降低核酸类药物的免疫原性并提升稳定性，经常需要开发对应的杂质分析和原料检测方法。

案例1：对胞磷胆碱钠及相关化合物分析

色谱条件

色谱柱：Gemini 5µm NX-C18, 4.6×250mm

流动相：磷酸三乙胺缓冲液

流速：0.5mL/min

柱温：30℃

进样量：20µL

波长：276nm

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假尿苷（Pseudouridine）是RNA上丰富的修饰核苷，又被称为RNA的“第五种核苷”。2005年，Katalin Karikó等人发现将假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性随着假尿苷引入比例的增高而降低。2008年，Katalin Karikó等人还发现用假尿苷替代尿苷的mRNA不仅能极大地降低mRNA的免疫原性，还能提高mRNA的稳定性并增强其翻译能力。2015年，Oliwia Andries等人发现用N1-甲基假尿苷替代尿苷比用假尿苷替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增强mRNA的蛋白表达能力。

这些研究提示，将假尿苷或N1-甲基假尿苷引入mRNA或许能有效降低mRNA疫苗的免疫原性，增强mRNA的稳定性，且增强其蛋白表达能力。

我们在IVT反应过程中，对反应体系中各种有效组分进行实时监控非常关键。

案例2：几种三磷酸尿苷的类似物用液相色谱法快速检测

色谱柱：Kinetex Biphenyl 100Å（3.0×150mm, 2.6μm）; P/N:00F-4622-Y0

流动相A：150mM三乙胺+15mM正己胺（用磷酸调节pH至7.8）

流动相B：甲醇

流速：0.5mL/min

检测器：260nm

柱温：40℃

自动进样器温度：8℃

图1. Kinetex Biphenyl上3种类似物混标丨谱图

因为三个类似物的结构高度相似，特别是UTP和Me-pUTP，疏水性极为相似，用普通的C18反相色谱柱难以分离。通过色谱柱筛选，我们发现Kinetex Biphenyl核壳固定相由于芳香族特殊的选择性，可以对几种同系物分离，该方法可以用于反应体系中组分的快速检测。

我们再展开一下

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mRNA药物生产工艺大致可分为5个模块：质粒生产、质粒线性化、体外转录合成反应（IVT）、mRNA纯化、LNP包封。针对mRNA的批量合成，目前较为高效的方式为体外转录（In Vitro Transcription, IVT）。IVT是一个相对复杂的酶催化过程，在合成mRNA的过程中，除DNA模板外，需加入所需的酶、三磷酸核苷酸及其它相关试剂。

三磷酸核苷酸极性很强，在反相色谱上保留很弱，由于结构非常相似，不能实现良好分离。通过添加离子对试剂来增强三磷酸核苷在C18色谱柱上的保留并改善分离。

案例3：5种三磷酸核苷酸单体的IP-RP分离

色谱柱1：Biozen Oligo（4.6×150mm, 2.6μm）; P/N:00F-4790-E0

色谱柱2：Clarity Oligo-RP（4.6×150mm, 3μm）; P/N:00F-4441-E0

流动相A：150mM三乙胺+15mM正己胺（用磷酸调节pH至7.8）

流动相B：流动相A:乙腈（1:1）

流速：0.8mL/min

检测器：260nm

柱温：50℃

自动进样器温度：8℃

进样量：1µL

图1. 色谱柱1 Biozen Oligo混标谱图

图3. 色谱柱2 ClarityOligo-RP混标谱图

因为三磷酸核苷酸的亲水性很强，在磷酸盐缓冲体系下的保留偏弱，分离度也不好。在反相离子对条件下可以发现保留明显增强，并且5个单体都可以很好的分离。

Biozen Oligo为2.6µm的核壳颗粒，跟3µm全多孔硅胶颗粒的Clarity Oligo-RP相比，可以看到峰更加尖锐，柱效和分离度更高；而后者的保留略强，峰的对称性更好。

反相离子对色谱条件需要在流动相中添加烷基胺类离子对试剂，流动相的pH比较高。如果是传统的硅胶颗粒C18柱，对寿命会有挑战。Biozen Oligo 2.6µm和Clarity Oligo-RP 3µm两款色谱柱均采用杂化硅胶技术，色谱柱可以耐受1-12的pH，更经久耐用。

案例4：分离CTGA四个核苷酸

色谱柱：Venusil AQ C18 10µm 21.2×250mm

流动相：A: 水（50mM甲酸铵） B: 甲醇:水=20:80

流速：20ml/min

波长：260nm, 280nm

进样量：1400µL（100mM单体CTGA各100µL混合后加流动相A 1mL）

Agela AQ C18 10µm填料，用甲酸铵的方法可以分离CTGA四个核苷酸。

案例5：改性核苷酸样品制备

仪器：Agela Astra中压制备系统

色谱柱：Flash HILIC 20-35μm 100Å 4g四支串联

流动相：A: 水（25mM乙酸铵） B: 乙腈:水=75:25（25mM乙酸铵, pH6.7）

流速：15ml/min

检测波长：260nm; 220nm

进样量：20mg

继续皮一下，

彩蛋依旧是热点应用分享

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对五种关键核苷进⾏了全⾯HPLC分析：腺苷、⻦苷、尿苷、胞嘧啶和N6-甲基腺苷（m6A）。⾊谱峰显⽰了不同的保留时间，说明了HPLC在分析核苷和修饰形式⽅⾯的多功能性【1】。

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生物素化寡脱氧核苷酸的合成纯化

紫外线诱导的6-4TT聚合后用Venusil MP C18醋酸铵体系纯化，采用UHPLC-Q-TOF/MS对制备的含ODN的6-4TT进行表征和碱性稳定性验证。生物素化的含6-4TT的寡脱氧核苷酸被用于筛选针对6-4TT光产物的高亲和力抗体。预计该合成的探针可用于检测与该病变结合的蛋白质并评估6-4TT DNA螺旋构象的影响【3】。

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（化学）酶促合成是传统化学方法的宝贵替代方案，但由于生物催化剂的生产成本过高，降低了此类工艺的可行性。然而在连续酶膜反应器（EMR）中可以提高生物催化剂使用率直到其失活，因此它们为使用自由溶解的酶进行间歇酶促反应提供了一种有价值的替代方案。在EMR中，酶通过合适的膜保留在反应器中。因此，可以避免载体材料上进行固化，以及酶活性的相关损失。使用自由溶解酶的EMR应用，有助于集成生物催化剂分离的连续过程，从而降低生物催化剂的总体成本并增强核苷生产的下游加工【2】。