奶粉中双氰胺的检测方法 （HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）
时间：2013-01-30 阅读：742
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北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然标准未对食品中的双氰胺*，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。
本文采用天津博纳艾杰尔科技的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。
双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。
1.2 实验步骤
提取、净化：称取1g试样于50mL具塞离心管中，加入2mL水溶解后，加乙腈定容至10mL，超声10min，8000r/min离心5min，取2mL上清液加入Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管填料，涡旋0.5min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22µm滤膜，待测。
1.3 实验条件
1.3.1液相色谱法（HPLC法）：
色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；
流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=10: 90；
波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：1mL/min。
1.3.2 LC-MS/MS法：
（1）色谱条件：
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；
流动相： 0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=10:90；进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.2 mL/min。
（2）质谱条件：
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：10.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：500.00。
表1双氰胺质谱信息
| 药物名称 | 监测离子对 | DP | EP | CE | CXP |
| 双氰胺 | 85.1/68.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
| 85.1/43.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
注：带“____”的监测离子对为定量离子对。
2.结果与讨论
2.1 液相色谱法：
2.1.1线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为0.1µg/mL，0.5µg/mL，1.0µg/mL，2.0µg/mL，5.0µg/mL和10.0µg/mL的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表2：
表2 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）
| 名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | zui低定量限（S/N=10） |
| 双氰胺 | 4.92min | Y=116.44X+3.2699 | 0.9997 | 0.1µg/ml |
2.1.2检测方法稳定性考察
选用10.0µg/mL的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表3：
表3 检测方法定性和定量稳定性考察考察（HPLC法）
| 标号 | 保留时间/ min | 峰面积 |
| 1 | 4.930 | 1061.7 |
| 2 | 4.933 | 1072.2 |
| 3 | 4.930 | 1064.4 |
| 4 | 4.929 | 1079.7 |
| 5 | 4.930 | 1067.3 |
| 6 | 4.934 | 1073.6 |
| RSD，% | 0.04 | 0.62 |
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表4
表4 10µg/g添加回收实验结果（HPLC法）
| 平行1，% | 平行2，% | 平行3，% | 平均值，% | RSD，% |
| 98.6 | 88.4 | 89.8 | 92.3 | 5.99 |
2.2 LC-MS/MS法
2.2.1线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液。
分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和500ng/mL的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表5：
表5 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）
| 名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | zui低定量限（S/N=10） |
| 双氰胺 | 3.15min | Y=8777.2X+7435.9 | 0.9993 | 5ng/mL |
2.2.2 检测方法稳定性考察
选用50.0ng/mL的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表6：
表6 检测方法定性和定量稳定性考察考察（LC-MS/MS法）
| 标号 | 保留时间，min | 峰面积 |
| 1 | 3.29 | 382950 |
| 2 | 3.30 | 387950 |
| 3 | 3.25 | 382840 |
| 4 | 3.31 | 399820 |
| 5 | 3.30 | 378580 |
| 6 | 3.30 | 383810 |
| RSD，% | 0.65 | 1.92 |
2.2.3准确度和精密度
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。
表7 100ng/g添加回收实验结果
| 平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 | RSD |
| 84.6% | 80.7% | 90.2% | 85.2% | 5.61% |
| 产品名称 | 规格型号 | 货号 |
| MAS-QuChERS-双氰胺净化管 | 100mg/2mL，50支/包 | MS-SQA01 |
| Venusil HILIC液相色谱柱 | 4.6*250mm，5μm，100Å | VH952505-0 |
| 2.1*150mm，5μm，100Å | VH951502-0 | |
| 微孔滤膜 | 0.22μm，直径13mm, 200/Pk | AM021320 |
| 双氰胺对照品 | 500mg /瓶，含量≥99.0% | DCD001 |
| 1g /瓶，含量≥99.0% | DCD002 | |
| 离心管 | 50mL，带螺纹盖，25个/包 | LXG0050 |
| 一次性无菌注射器 | 5mL,100/pk | ZSQ-5ML |