小鼠免疫球蛋白E(IgE)作为免疫反应中的重要组成部分，在多种生物学研究和临床应用中具有举足轻重的地位。小鼠IgE试剂盒，特别是基于酶联免疫吸附测定(ELISA)技术的试剂盒，已成为定量检测小鼠血清、血浆及相关生物样本中IgE含量的重要工具。本文将详细介绍该试剂盒的操作步骤及需要注意的关键事项，帮助研究人员和实验室技术人员更好地使用这一工具。
 

　　一、操作步骤
 

　　1、准备阶段
 

　　1.1 试剂复温：从冰箱取出试剂盒，室温下复温平衡约30分钟，确保各组分达到适宜的检测温度。
 

　　1.2 洗涤液配制：用蒸馏水将试剂盒中提供的浓缩洗涤液稀释至工作浓度。通常，按照1:20的比例进行稀释，即每份浓缩洗涤液加入19份纯水。
 

　　2、样品与标准品准备
 

　　2.1 加样：在酶标包被板上设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔。标准品孔中依次加入不同浓度的标准品各50μl，待测样本孔中先加入样本稀释液40μl，再加入待测样本10μl(最终稀释度为5倍)。空白对照孔不加任何试剂。
 

　　2.2温育：用封板膜封板后，置于37℃温育30分钟，使样本中的IgE与包被在板上的抗体充分结合。
 

　　3、洗涤与加酶
 

　　3.1 洗涤：温育结束后，小心揭掉封板膜，弃去孔内液体，并在吸水纸上拍干。随后，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤4次(或使用洗板机进行自动化洗涤)，确保去除未结合的成分。
 

　　3.2 加酶：每孔加入酶标试剂50μl(空白对照孔除外)，再次封板后置于37℃温育30分钟，使酶标抗体与已结合的IgE形成复合物。
 

　　4、显色与终止
 

　　4.1 显色：温育结束后，每孔先加入显色剂A液50μl，再加入显色剂B液50μl，轻轻震荡混匀，置于37℃避光显色15分钟。在此过程中，底物在辣根过氧化物酶(HRP)的催化下转化为蓝色产物，随后在酸的作用下转变为黄色。
 

　　4.2终止：每孔加入终止液50μl，终止显色反应(此时颜色由蓝色立即转变为黄色)。
 

　　5、 结果测定
 

　　5.1 吸光度测定：在终止反应后15分钟内，使用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度(OD值)。以空白孔调零，记录并保存数据。
 

　　5.2 浓度计算：根据标准品的浓度及其对应的OD值，绘制标准曲线，并计算回归方程。根据待测样本的OD值，在回归方程上计算出对应的IgE浓度。由于样本进行了5倍稀释，因此最终浓度需乘以5。
 

　　二、注意事项
 

　　1. 样本处理：样本采集后应尽早进行提取，并按相关文献进行操作。避免使用含NaN3的样本，因为NaN3会抑制HRP的活性。
 

　　2. 操作规范：实验过程中应严格遵守说明书操作，确保每一步骤的准确性和重复性。所有标准品、样本和空白对照都应做双份检测，以减小实验误差。
 

　　3. 交叉污染：为避免交叉污染，每加一个样本或试剂就应更换一次吸头。酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分应悬臂加样，不得碰到微孔。
 

　　4. 试剂保存：试剂盒应在2-8℃条件下避光保存，不同批号的试剂不得混用。未开封的酶标包被板应装入密封袋中加干燥剂保存。
 

　　5. 结果解读：实验结果的判定应以酶标仪读数为准，避免主观判断。若显色过浅，可适当延长底物温育时间，但需注意控制时间以避免背景过高。
 

　　综上所述，小鼠IgE试剂盒在操作过程中需细致入微，从试剂复温、样本处理到结果测定，每一步都需严格按照说明书执行。只有这样，才能确保实验结果的准确性和可靠性，为科学研究提供有力的数据支持。